利用NCBI设计特异性PCR引物的方法

一般来说,获取引物的方式有5种:

1),查询相关文献(建议参考IF≥5的文献);

2),引物合成公司在线设计(如:

金斯瑞,http://www.genscript.com.cn/DNA_Oligo.html?src=mostpopular

生工,https://www.sangon.com/newPrimerDesign(需注册并登录));

3),Primer 5.0引物设计软件;

4),引物数据库(如Primerbankhttps://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/);

5),NCBI在线设计。

利用文献检索引物或引物合成公司在线设计都无法保证引物的特异性,引物数据库则有时无法找到所需物种对应的引物,而设计软件又存在诸多规则,短时间内难以掌握,而NCBI在线设计引物则可避免以上遗憾,成为科研道路上的有力助益。

 

1、检索目的基因序列

打开NCBI官网(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),将搜索数据库改为“Gene”,在搜索栏输入目的基因及种属;

打开目的基因链接(注意链接后面有关该基因的描述,不要选错物种来源了哦)

在新打开的页面中找到“NCBI Reference Sequences (RefSeq)”,选择“NM_******”打开链接

在新打开的页面中找到目的基因序列,复制(记得是全部序列哦);

2、利用数据库设计引物

打开NCBI官网,在页面最下方找到“Primer-BLAST”,打开链接;

将目的基因序列粘贴在页面左上的框框里;

“Primer Parameters”条目下将“PCR product size”修改为Min=100,Max=300(荧光定量PCR法的有效扩增范围为70~350 bp,若要扩增更大的目的基因片段需增加延伸时间);

在该条目下找到“Primer melting temperatures(Tm)”设置所需引物的退火温度(一般设置为55℃~63℃)

在“Primer Pair Specificity Checking Parameters”条目下

将“Organism”后默认的人源种属更改为目的基因来源种属;

单击页面下方“Get Primers”,先去找静静聊聊,再回来看结果(一般需等待3~5 min网站才能反聩设计结果)

3、选择合适的引物

网站一般会反聩10条引物供选择,筛选满足下列条件的引物:

1),连续相同的碱基≤3个;

2),GC所占比例在40%~60%之间;

3),引物自身或两条引物间不能有连续4个碱基互补;

4),引物长度在15~30个碱基之间;

5),引物3’端尽量不要以“A”结尾,但也应避免连续3个“G”或“C”。

4、初步验证引物特异性

   (由于页面显示原因,在设计结果页面上给出的扩增结果有时并不是全部的可能扩增结果,因而需利用Primer-BLAST再次验证)

打开“Primer-BLAST”页面,在“Primer Parameters”条目下的两个框框里分别输入选定引物的正向序列和逆向序列,

在下方修改引物所扩增基因的种属,“Get Primers”,等待数据库测试结果。

若反聩页面的“Products on target templates”中存在70~350 bp之间的非目的基因片段,则该引物可能存在非特异性扩增,该引物不可用;若扩增出非目的基因片段>350 bp,则该引物可能不存在非特异性扩增,引物可用,但以非目的基因片段>500 bp为妥。

若存在“transcript variant X*”一类产物,是目的基因在转录后的不同剪切体,一般不影响引物特异性,该引物可用。

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