Tunnel法检测细胞凋亡,非特异性染色是怎么回事?

[背景]

TUNNEL(TdT-mediated dUTP nick and labeling)是检测细胞凋亡的常用方法之一,我的实验中也涉及使用该方法检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况,使用的某公司的TUNEL细胞凋亡检测试剂盒,但是DAB染色后发现,基本上大部分的细胞都被染色了。非特异染色的情况比较严重,简直都无法辨别阳性特异染色。

[困惑]

这些非特异性染色是如何产生的呢?是由于实验过程中的多次清洗不够到位,或者是内源性过氧化物酶灭活不理想,还是由于DAB染色、苏木精复染等环节出现问题呢?

[探索]

通过对Tunnel实验原理和各步骤地分析,结合对照组图片的结果,初步考虑从增多清洗次数、延长清洗时间,加强灭活内源性过氧化物酶,以及缩短DAB 染色、苏木精复染时间这几个方面进行探索。

1.  清洗步骤不够彻底?

处理:增加清洗次数、延长清洗时间。

方法:使用PBS清洗,每个清洗步骤清洗3次,时间由原来的3分钟延长到5分钟,同时注意在清洗后尽量除去PBS溶液后再进行后续操作。其余操作参照实际说明书。

结果:效果不明显,非特异性染色情况仍很严重。

结论:排除清洗方面的原因。

2.  内源性过氧化物酶灭活时间不够?

将样品浸入到0.3%H2O2溶液中15分钟以灭活内源性过氧化物酶。有没有可能是因为灭活的结果不理想造成的非特异染色呢?

处理:延长内源性过氧化物酶灭活时间到20分钟。

方法:实验方法同前。

结果:非特异性染色的结果有所改观,但仍然不够理想。

结论:内源性过氧化物酶灭活时间不够,是发生非特异性染色的原因之一。

3.  在DAB显色液中的孵育时间过长?

处理:缩短DAB显色时间。

方法:主要根据镜下观察到出现浅棕色背景时即可,而不盲目按照说明书推荐的染色10分钟。

结果:在4分钟左右就已出现浅棕色背景,随即停止DAB孵育。结果显示非特异染色明显减少。

结论:DAB显色液中孵育时间过长是造成本次非特异性染色较重的原因之一。

4.  苏木精复染时间过长

处理:参照文献,将苏木精复染的时间控制在3秒左右。

方法:实验方法同前。

结果:终于获得了比较理想的图片。

结论:为了较好地控制非特异性染色,在适当延长内源性过氧化物酶灭火时间,缩短DAB染色时间的基础上,还需要控制好苏木精复染的时间。

[收获]

此次实验非特异性染色情况较严重的原因是内源性过氧化物酶灭活不充分、DAB显色时间较长和苏木精复染过重几方面共同造成的,经过统一处理后得到明显改善,非特异染色明显减少。

[箴言]

加强灭活内源性过氧化物酶、缩短DAB显色时间以及适当的苏木精复染时间对于避免非特异性染色非常重要。

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