中药5分SCI文章的研究思路

2019年10月25日,我国对中医药工作做出重要指示,要将中华文明的瑰宝中医药事业大力发展,推动中医药走向世界。可见未来的几年,中医药事业将会迎来全面的支持于发展。

今天小编给大家带来的就是一篇以中药为主的研究。这篇文章是广州中医药大学在Cell Death &Disease杂志上发表的,影响因子5.959分,属于细胞生物学和生理学的二区杂志。

背景

桦木醇是天然存在的五环羽扇豆型三萜类化合物,来自桦树皮提取物,具有潜在的保肝,抗炎,抗艾滋病毒,抗增殖和抗癌等作用。在其各种衍生物中,lup-20(29)-en-3β,28-二-基-硝基氧乙酸酯(NBT)在抑制癌细胞方面最有效,特别是在HepG 2和人乳腺癌细胞(MCF-7)细胞中效果显著。

细胞表型研究——NBT抑制癌细胞增殖

作者首先发现利用不同浓度的NBT用处理细胞在500μM时表现出40%的抑制作用。此外,NBT以时间和剂量依赖的方式抑制MCF-7细胞的增殖。随后作者在人类正常细胞(MCF10A,BEAS-2B和L-02)中检测到NBT的毒性。在不同浓度处理24小时后,NBT对上述细胞株均未显示出任何毒性作用,而用24μM的NBT处理BEAS-2B细胞48小时显示出50%的抑制。

细胞表型研究——NBT激活MCF-7细胞中的G0/G1检查点

在24μM的NBT作用24 h后流式检测出G0/G1期细胞大量积聚,表明NBT可诱导细胞阻滞于G0/G1期。并且呈剂量依赖性的细胞周期停滞在G1期。此外,在NBT处理组中,cyclinD1 mRNA和蛋白均显著降低,同样呈剂量依赖性。

分子机制研究——线粒体途径在NBT诱导的凋亡细胞死亡中起关键作用

随后作者想要确定NBT的细胞毒性作用是否与细胞凋亡有关。实验结果表明NBT处理的MCF-7细胞凋亡率高于对照组,且呈浓度依赖性,同时NBT处理组的凋亡基因Caspase-9表达呈剂量依赖性增加。PARP表达的显示出类似的变化。这些结果表明,NBT以剂量依赖的方式诱导MCF-7细胞凋亡。NBT处理MCF-7细胞的ΔΨm(线粒体膜电位)损失也呈剂量依赖型增加,ΔΨm的丢失直接反映了NBT对线粒体功能的影响。抗凋亡的bcl-2和促凋亡的bax蛋白主要调节ΔΨm,所以作者之后发现经NBT处理后,bax/bcl-2比值逐渐升高。线粒体分裂在线粒体凋亡中起关键作用,导致drp1和fis1诱导的线粒体断裂和融合蛋白mfn1和mfn2水平降低。WB结果表明,NBT以剂量依赖的方式增加Drp1和Fis1,但降低Mfn2。

上游机制研究——NBT促进乳腺癌细胞自噬

作者之后利用ATG5,LC3I/II和p62检测NBT诱导MCF-7细胞自噬。Western blot显示,经NBT处理后自噬标志基因显着增加。随后作者使用RAPA和CQ验证经NBT处理的MCF-7细胞产生大量的自噬体,同时用hoechst 33258荧光染料染色加以验证。这些数据表明NBT不仅诱导MCF-7细胞凋亡,而且还诱导了完整的自噬过程。

上游机制研究——NBT联合CQ通过过度积累自噬体诱导线粒体凋亡

根据Annexin V/PI染色试验,NBT和CQ在MCF-7细胞中共同处理后导致凋亡显着增加,数量比单独处理时更多,同时,caspase-9和PARP活性增加,Bax/Bcl-2和Cyt C也明显增多。此外,NBT和CQ组合处理高了Drp1和Fis1水平,降低了Mfn2水平并观察到更多的自噬小体。此外,NBT和CQ的结合增加了ATG5,LC3B-II和p62的水平,导致自噬小体过度积累。总之,这些结果表明抑制自噬可以增强NBT诱导的线粒体分裂,通过自噬小体的积累导致更多的MCF-7细胞凋亡。

动物实验验证——NBT对MCF-7来源的裸鼠异种移植瘤生长的抑制作用

作者最后对NBT的体内抗肿瘤活性进行了评价。NBT 腹腔注射后肿瘤生长与对照组相比显著降低。体重、器官系数和生化参数没有明显变化。HE染色显示,在NBT或BT治的肿瘤中观察到纤维化、坏死和炎症细胞浸润。TUNEL结果显示,NBT处理引起的TUNEL阳性细胞多于对照。

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