张锋发布新冠病毒的CRISPR检测详细操作方法并免费提供试剂盒

2月14日,CRISPR基因编辑大神张锋教授团队发布了使用基于CRISPR/Cas13SHERLOCK技术检测新型冠状病毒的详细操作流程文档
文档中的测试表明,SHERLOCK技术检测新冠病毒异常灵敏,每微升里仅10-100个病毒拷贝,都可以被检测出来。而且,该方法操作简单,仅需纯化的核酸分子样本,通过简单的三步,1个小时内即可完成检测

此外,张锋强调,由于他们无法获取新型冠状病毒患者样本,因此无法使用真实的患者样本来验证这一技术。同时,他们欢迎有新型冠状病毒肺炎(COVID-19)样本的研究人员联系,可以免费提供用于检测的试剂盒

张锋表示,希望该protocol可以为有兴趣进一步开发该诊断系统的研究人员提供参考,也欢迎研究人员与之联系以寻求帮助或指导
SHERLOCK技术张锋团队于2017年发明,此后在拉沙热埃博拉寨卡病毒登革热等RNA病毒疫情检测中大显身手。
Cas13是一种依赖于RNA靶向的RNA核酸酶,专一的切割RNA,不切割DNA。世界上许多最常见或致命的人类病原体都是RNA病毒(例如埃博拉病毒、艾滋病病毒流感病毒、SARS病毒)此次在武汉爆发的新型冠状病毒,同样是RNA病毒
张锋团队,针对此次新型冠状病毒,设计了两个向导RNA(gRNA),分别用于识别新冠病毒的S基因Orf1ab基因
为最大化提高检测特异性和准确率,设计的向导RNA以最大程度减少对人类呼吸系统相关病毒的脱靶性。

这样,一旦检测样本中含有新型冠状病毒,向导RNA就会识别到它的S基因Orf1ab基因,进而引导Cas13切割这两个病毒基因。通过让被切割的RNA形成条带,形成视觉可见的结果,清晰直观展示病毒检测结果。

2019年底,武汉市出现因新型冠状病毒感染导致的肺炎疫情,截至2月15日上午,全国已有超过6.6万人感染,并造成超过1500人死亡。

疫情爆发初期,用于确诊的real-time PCR检测试剂盒供应不足,导致许多疑似病例迟迟不能确诊。
近期检测试剂盒供应量上来后,不少案例发现,试剂盒检测为阴性的,实际已经感染新冠病毒,而且,real-time PCR检测耗时长、操作复杂,难以满足快速增长的疑似病例排查需求。

对于武汉此次爆发的急性病毒性疫情来说,检测试剂盒的灵敏性检测速度价格操作简便性等缺一不可。

SHERLOCK技术的发明
CRISPR/Cas系统是细菌和古菌特有的免疫系统,是生命进化历史上,细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器,用于抵抗病毒或外源性质粒的侵害。当外源基因入侵时,该防御系统的 CRISPR 序列会表达与入侵基因组序列相识别的 RNA,然后 CRISPR 相关蛋白(Cas,一种核酸内切酶)在序列识别处切割外源基因组DNA,从而达到防御目的。
CRISPR技术是在20世纪90年代初发现的,2013年2月15日,张锋等人将CRISPR/Cas9系统成功应用于哺乳动物和人类细胞的基因编辑,此后迅速成为人类生物学、农业和微生物学等领域最流行的基因编辑工具。
根据效应核酸酶组成的亚基数量,CRISPR/Cas系统可以分为两类:第一类系统的核酸酶由多个亚基组成;第二类系统特别受关注,其核酸酶由单一的蛋白组成,包括基于Cas9、Cas12和Cas13效应蛋白的II、V和VI型。其中,与大多数Cas蛋白不同,Ⅵ型系统的核酸酶Cas13是一种依赖于RNA靶向的RNA核酸酶,专一的切割RNA,不切割DNA,在分子诊断方面具有重要的应用价值
世界上许多最常见或致命的人类病原体都是RNA病毒(例如埃博拉病毒寨卡病毒艾滋病病毒流感病毒等)此次在武汉爆发的新型冠状病毒,同样是RNA病毒
2017年4月,CRISPR基因编辑大牛张锋,在 Science 杂志发表论文,发明了基于CRISPR/Cas13的病毒检测技术
张锋将这种检测技术命名为——SHERLOCK,这一与神探夏洛克·福尔摩斯同名的检测技术,可以让被切割的RNA形成条带,形成视觉可见的线索,并直观展示出来。
SHERLOCKspecifichigh-sensitivity enzymatic reporter unlocking)
相比于传统的real-time PCR检测,SHERLOCK检测技术准确度更高,而且价格和检测所需时间也减少了一半
张锋,CRISPR领域的奠基人之一,最早将CRISPR应用于哺乳动物和人类细胞
SHERLOCK大显身手
2018年,非洲尼日利亚爆发拉沙病毒,张锋所在的Broad研究所与尼日尼亚展开合作,使用SHERLOCK检测技术检测拉沙病毒。由于尼日利亚经常发生断电,而聚合酶链式反应(PCR)检测对电力依赖强,而SHERLOCK对于断电不像PCR对断电那么敏感,再加上SHERLOCK成本更低,时间更快,大大提高了病毒检测效率。据估计,SHERLOCK检测技术的应用,帮助减少了对尼日利亚拉沙病毒60%的死亡率。
Jennifer Doudna:CRISPR领域的奠基人之一
此外,CRISPR基因编辑奠基人Jennifer Doudna和她在伯克利的团队也开发了基于CRISPR/Cas12a的检测技术,用于检测人乳头瘤病毒(HPV)病毒。Jennifer Doudna希望这一检测工具能够帮助遏制宫颈癌死亡人数的上升,对于发展中国家和非洲等地的国家,疾病通常被诊断发现时已经太晚。
南美洲国家洪都拉斯和美国加州的科学家正在测试针对登革热病毒寨卡病毒和与癌症相关的人乳头瘤病毒(HPV)毒株的CRISPR检测诊断。
2018年,非洲刚果民主共和国爆发新的埃博拉疫情,张锋的同事、SHERLOCK检测技术的负责人、Broad研究所研究员 Parson Sabeti 第一时间对来自感染者的病毒样本进行了测序,从DNA数据中清楚确定了病毒传播的途径。参与这项工作的许多科学家在这次疫情中感染死亡,但换回了更多生命。她因此被评为《时代周刊》2014年度人物,当之无愧的“埃博拉斗士”。
非洲刚果民主共和国也正在进行一项针对埃博拉病毒的CRISPR检测的探索性研究。
特别值得一提的是,Jennifer Doudna团队和张锋团队之间虽然正在进行的激烈的专利争夺战。但双方均表示,他们致力于授权CRISPR检测工具,以便需要这些诊断的人可以使用它们
SHERLOCK还能消灭病毒
2019年10月10日,麻省理工学院和哈佛大学Broad研究所的Pardis C. Sabeti张锋等人在Cell 子刊 Molecular Cell 杂志发表了题为:Programmable Inhibition and Detection of RNA Viruses Using Cas13 的研究论文。
Parson Sabeti张锋将Cas13的抗病毒活性与其诊断能力结合起来,建立了一个强大和快速可编程的诊断和抗病毒系统,命名为CARVER (Cas13辅助的病毒表达和读出限制)以检测和消灭人类细胞中基于RNA的病毒。该系统将来可能用于诊断和治疗病毒感染(包括由新病毒和新兴病毒引起的感染)
注:CARVERCas13-assisted restriction of viral expression and readout,同时,CARVER也有雕刻师的意思
研究人员通过实验测试了Cas13在分别感染了三种不同RNA病毒的人类细胞中的活性:淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)甲型流感病毒(IAV)疱疹性口炎病毒(VSV)。研究人员将Cas13基因片段和一种工程化的引导RNA导入细胞,24小时后,将细胞暴露在病毒中。再过24小时后,Cas13酶使细胞培养中的病毒RNA水平降低了多达40倍
研究小组进一步研究了Cas13对病毒感染性的影响——换句话说,剩余的病毒有多少可以继续感染人类细胞。数据表明,在病毒暴露8小时后,Cas13将流感病毒的传染性降低了300多倍
为了增加诊断需求,研究人员还采用了基于Cas13的核酸检测技术SHERLOCKspecifichigh-sensitivity enzymatic reporter unlocking)。这个三合一的CARVER系统可以快速测量样品中病毒RNA的剩余水平。
这项研究表明,基于CRISPR/Cas13的基因编辑工具,不仅能用于病毒的快速检测诊断,还能用于清除病毒,治疗病毒引起的疾病
国内相关研究情况
2018年3月12日,中科院上海植物生理生态研究所王金博士等在 Cell Research 杂志上发表了题为:CRISPR-Cas12a has both cis- and trans-cleavage activities on single-stranded DNA 的研究论文。
该研究深入系统地研究了Cas12a对于靶标ssDNA和非靶标ssDNA的切割特性。表明Cas12a可用于对单链DNA病毒的快速检测
值得一提的是,该研究论文投稿时间比Jennifer Doudna团队的类似研究论文投稿时间更早,这也说明我国在CRISPR领域已经达到国际领先水平。
结语
对于大多数传染病来说,诊断需要专业的知识,先进的设备和充足的电力 ,而这些要求在许多爆发疫情的地方都达不到。
对于快速爆发的病毒性疫情,快速检测和确诊现得尤为重要,早一分一秒,就意味着更早一些控制疫情蔓延,减少人员伤亡。
目前正在使用的real-time PCR检测技术虽然在新冠病例确诊和疑似病例排查中发挥了重要作用,但是受操作复杂耗时长需集中送检等限制,不能满足当前快速增长的大量疑似患者、无症状感染者的排查诊断需求。
基于CRISPR的病毒检测工具提供了与传统方法一样、甚至更高的诊断准确率,并且非常简单易操作,检测所需时间也缩短一半。
参考内容:
https://doi.org/10.1016/j.molcel.2019.09.013
https://doi.org/10.1126/science.aam9321
https://doi.org/10.1038/s41422-018-0022-x
研究进展

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张锋发布新冠病毒的CRISPR检测详细方法

2020-2-15 16:36:10

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