Western Blot新手入门(最详细的实验步骤及原理讲解)

引言:

进实验室以后,一般第一个要学的就是WB这个大实验。虽然很基础,但是却必不可少。尽管在课堂上已经简单的学习过WB的原理,但是真的跟着学长学姐一步步学习起来的时候还是难免觉得笨拙,尤其是每一步要做什么,为什么要这么做,更是不甚了解。

因此我整理了WB的步骤、每一步的原理,希望大家看完本文能有所收获~

一、配胶

原理:

30% acrylamide mix产生凝胶的基本物质

1.5M Tris(ph 8.8) 使分离胶PH为8.8(与甘氨酸的pka接近,从而使不同分子量的蛋白产生不同的电泳速度,从而使不同分子量的蛋白分开)1.0MTris(ph 6.8)使浓缩胶PH为6.8(可以通过甘氨酸和氯离子的作用产生压缩,从而使蛋白条带压细)

10% SDS阴离子去污剂:断裂分子内和分子间氢键,破坏蛋白质二三级结构,消除蛋白质在迁移过程中结构的影响。与蛋白质形成SDS-蛋白质复合物,由于SDS带有大量负电荷,蛋白质本身的电荷被掩盖,从而消除蛋白质迁移过程中自身电荷的差异造成的影响。同时能够助溶,蛋白质变为亲水,容易在水相中迁移。每克多肽可以与1.4g去污剂结合,当分子量在15kd-200kd之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,logMW(分子量)=K-bx(迁移率)

AP提供acr丙烯酰胺和bis亚甲丙烯酰胺聚合的氧自由基,是acr和bis聚合的引发剂

TEMED催化AP释放氧自由基,是反应的催化剂

(图1:配胶试剂)

1、清洗干净1.5mm或1mm玻璃板,检漏(有豁口和字的朝上)

 

2、倒掉水,配10ml 10%的分离胶(1.5mm板需要7ml,1mm板需要4.5ml)

(图2:不同浓度配胶方案)

10%方案如下:

H2O 4.0ml
30% acrylamide mix 3.3ml
1.5M Tris(ph 8.8) 2.5ml
10% SDS 0.1ml
10% ammonium persulfate 0.1ml
TEMED 0.004ml

3、混合后上下摇晃,注意不要放在手中配(否则温度太高凝固的快),静置15s后用1ml枪二档吸一档打(在一角加即可,不用来回加,否则容易出气泡。不过出气泡了也没事,加水压一下就浮上来了)

4、加进玻璃板中,随后均匀来回加水到满

5、等待20分钟

6、倒掉水,将架子倒置过来让水排干,用纸巾擦拭斜角(一定要擦干净所有的水!否则两层胶之间出现水层就废了),同时配浓缩胶4ml

H2O 2.7ml
30% acrylamide mix 0.67ml
1.0M Tris(ph 6.8) 0.5ml
10% SDS 0.04ml
10% ammonium persulfate 0.04ml
TEMED 0.004ml

7、加满分离胶后插入1.5mm或1mm的梳子,注意不要有气泡,等待20min

(图3:配好的胶)

二、测定蛋白浓度
原理:A液是质量浓度为0.1g/mL氢氧化钠溶液(20ul protein assay S+1ml protein assay A),B液是质量浓度为0.01g/mL硫酸铜溶液。当底物中含有肽键时(多肽),试液中的铜与多肽配位,络合物呈紫色。可通过比色法分析浓度。双缩脲试剂中真正起作用的是硫酸铜,而氢氧化钠仅仅是为了提供碱性环境。
1、按照如下要求在96孔板中加样(BSA浓度1ng/ul)

 

标准1 标准2 标准3 标准4 标准5 样品1 样品2 样品3 样品4
H2O 10ul 7.5ul 5ul 2.5ul 0ul
BSA 0ul 2.5ul 5ul 7.5ul 10ul
样品 10ul 10ul 10ul 10ul
A液 25ul 25ul 25ul 25ul 25ul 25ul 25ul 25ul 25ul
B液 200ul 200ul 200ul 200ul 200ul 200ul 200ul 200ul 200ul

(图4:A液体,B液,S液)

2、将96孔板摇15min

(图5:96孔板)

3、使用软件测定蛋白浓度

双击打开software→open/close→放入96孔板→open/close→protocols→protocal manager→protein Quant→DC protein Assay→plate 1→setting→read area→勾选加样区→read

4、使用计算机excel做直线回归,根据标准曲线计算需要加多少样品和buffer

标准曲线:如图输入数据,x为吸光度,y为浓度。勾选区域,图标→散点图。右键任意一个点,选择趋势线,勾选显示公示。然后根据公示计算样品的浓度。

 

样品加入量:100或50/浓度

原理:上样量50-100ug足够。如果蛋白浓度太高导致上样过小,可用裂解液稀释蛋白使总上样体积在10ul即可,勿用水稀释会改变PH值。上样不要过高,否则条带兜一大坨。

4xloading Buffer加入量:样品/3

原理: Loading buffer里边的指示剂溴酚蓝和二甲苯氰FF起到指示的作用,显示电泳的进程,以便我们适时终止电泳;第二,里边的成分甘油可以加大样品密度,使样品密度大于TAE,从而沉降到点样孔中,防止样品飘出点样孔。另外,有的Buffer是加有SDS的,一般都会写明。SDS主要是促使聚合酶变性,因为没有除尽的聚合酶会结合在DNA双链上影响它的迁移速率。细胞裂解后的裂解液,加loading100℃加热,也是为了中止酶促反应,防止提取的蛋白质降解。

 

(图6:直线回归)

三、跑胶

1、取出胶,按照豁口在内摆放(若只有一块胶,另一边则用塑料板装上,总之要封闭这个小槽)。放入盒中,注意对准电极(黑对黑,红对红),同时放在盒子有突起的那一边(到时候盖盖子才能盖上)。

如果同时要跑四块胶,那么就要用没有金属电极棍子伸出来的装胶盒放在无突起侧(反正你能把盖子盖上去就没错了,盖不上去就是放错位置了)。

2、加样混匀(先震荡后快速离心),PCR机器中100℃孵育5min

原理:通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷,由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关,因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。

 

(图7、8:蛋白样品)

(图9、10:100℃孵育5分钟)

3、将样品加入孔中,两端为8ul和4ul的marker

4、制备10xrunningbuffer:Tris base30.3g,Glycine 144.1g,SDS10g,ddH20到1L

制备1xrunningbuffer:900mlddH20+100ml 10xrunning buffer

5、跑胶100V30min(浓缩胶),130V 50min(分离胶),跑到底部。注意观察底部铁丝是否冒气泡,开始冒气泡则说明成功跑起来啦!

(图11:跑胶)

四、转膜

1、甲醇活化PVDF膜10min

原理:PVDF膜是疏水性的,膜孔径有大有小,随着膜孔径的不断减小,膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。大于20000的蛋白选用0.45um的膜,小于20000的蛋白选用0.2um的膜。PVDF膜在使用时需预处理,用甲醇处理的目的是活化膜上的正电基团,使其更容易与带负电的蛋白结合。

 

(图12:甲醇活化)

2、制备1xtransferbuffer(冰上保存)

10xtransferbuffer:tris 30.3g+Glycine144g+ddH20到1L

11xtransferbuffer:100ml10xtransferbuffer(一般都放在冷室里)+100ml甲醇(一般都在通风橱)+800mlddH20

3、关闭电源,取出胶,切去不用的区域,并在左上角做标记(目的是标记第一个条带的上方。分不清楚的话看marker颜色也行,第一条marker加的8ul,颜色浓。),同时立刻清洗玻璃板,留给下一个人一块干净的玻璃板。

(图13:切胶)

4、在玻璃盒中加入转膜buffer,做三明治(黑底在下):海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵

注意:不要有气泡!不要将胶放干!

原理:电场力作用条件下,带电粒子(PAGE胶中的蛋白)会发生定向迁移

(图14:三明治)

5、将三明治夹起后放入电泳盒(黑对黑,白底朝上),倒满转膜buffer并放入2个冰盒,盖上盖子放到一个盒子里,外周也塞满冰,插电跑胶室温100V  60min或者4℃冷室内30V转膜过夜(过夜的话最好加入转子散热均匀)。

原理:转膜过程会产热导致蛋白质降解,因此要使用冰散热

(图15、16:转膜)

五、加抗体曝光

1、配5%牛奶:2.5g脱脂奶粉+50ml1xTBST

(图17:配牛奶)

2、在膜左上角(目的还是为了标记第一个条带,但是上下不要弄反了。加样出发的地方是上,蛋白跑到最后的地方是下。)做标记,放入牛奶中摇1h。

原理:PVDF膜上有许多孔洞尚未结合蛋白,若不封闭这些地方,一抗就会非特异性结合上去。因此需要用牛奶中的蛋白质结合这些孔洞。

 

(图18:封闭)

3、用塑料膜包裹,对着marker标记一下大小。根据样品蛋白的大小区域裁剪成条带,左上角剪角。加一抗,4℃过夜/室温2h摇晃。回收一抗,用1xTBST洗4次,每次10min。

原理:待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物,这样清洗除去未结合的一抗后,只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。

(图19:蛋白质大小)

4、倒尽TBST,加入二抗孵育摇晃2h,之后再用1xTBST洗4次,每次10min。

原理:用一抗处理过的PVDF膜再用标记的二抗处理,带有标记(HRP辣根过氧化物酶)的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置,即是待研究的蛋白质的位置。

 

(图20:孵育/洗膜)

5、将PVDF膜擦干净,放在曝光盒的膜中央,滴加显影液HRP(辣根过氧化物酶底物)浸润满,阖上膜,注意不要有气泡,盖上盒子

备注:有另一种ECL工作液,包括鲁米诺和过氧化物,二者避光保存,现配现用(1:1配制),用时滴在膜上就行

原理:二抗中的辣根过氧化物酶催化过氧化氢,底物被氧化产生发光效应

(图21、22:显影)

6、到暗室里,锁上门,打开曝光盒,擦去多余的液体并放入胶片10s/30s/1min(时间根据胶片情况而定),放入机器中曝光。

注意:不用打开塑料膜!贴在塑料膜上即可!

(图23、24:曝光)

六、结果标记和保存

现在你获得了一张完美的WB胶片结果,但是为了方便日后查看,所以需要在胶片上标记:样品名称,一抗名称,marker条带和大小,你的名字,日期。

然后拿去电脑上扫描,保存一份电子版。

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6 条回复 A文章作者 M管理员
  1. 非常地有帮助!!!

  2. 感觉很有帮助,学习到了

  3. 最常见也是坑最多的实验

  4. 学习一下👍👍👍👍👍

  5. 最常见也是坑最多的实验

  6. 天啊,新手友好帖!!!

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