文献解读:miRNA研究搭上m6A的热点研究思路

大家好,我是土豆,上期给大家分享了一篇关于mRNA的m6A相关文献,这期和大家分享一篇miRNA的m6A相关文献。
我感觉讲miRNA有一定意义,因为过去10年很多小伙伴的课题组都研究过miRNA,为了保持课题的延续性,从RNA甲基化角度继续研究过去的miRNA指标可能是一个不错的思路。
接下来正式文献解读,作者团队来自班主任所在的南京医科大学,这篇文章的题目是:METTL14 Suppresses CRC Progression via Regulating N6-Methyladenosine -Dependent Primary miR-375 Processing。这篇文章发表在Molecular Therapy上,目前影响因子是:8.402
先来看研究背景:
这篇文章主要介绍了METTL14通过m6A依赖途径影响miR-375前体成熟进而抑制结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)发展的作用机制。研究背景是分了3个部分:1. CRC的危害等背景;2. m6A相关基因和蛋白的介绍;3. 本研究拟开展的工作:METTL14在CRC组织和细胞中表达;METTL14在体内外对CRC表型的影响;METTL14影响表型的具体作用机制。
 
作者的初心我猜是想靠上研究热点m6A,他们是怎么靠上这个热点的,直接检测组织中METTL14的表达,直接硬靠,厉害了。
 
文章结果如下:
图1.  METTL14在CRC细胞和组织中低表达,METTL14高表达的患者预后良好。
图1 A:qPCR结果提示METTL14在CRC细胞中表达低于正常结直肠细胞。
图1 B:qPCR结果提示METTL14在CRC患者组织中表达低于正常组织。
图1 C:IHC结果提示METTL14在CRC患者组织中表达低于正常组织。
图1 D:生存分析提示METTL14高表达的CRC患者预后良好。
总结: 基本上就是硬靠上的研究热点m6A。小伙伴自己研究时最好分析下公开数据库的数据如TCGAGEO等。不足:图1没有WB水平检测METTL14表达的结果。此外,IHC的图染的不太好。
PS:建议大家做表达检测的时候 qPCR、WB和IHC的检测结果最好都有,这样数据完整度才高。
图2.  敲低MELLT14促进CRC细胞增殖。
图2 A:检测两种不同细胞系中MELLT14的敲低效率。
图2 B:敲低MELLT14后m6A的水平明显降低。
图2 C-E:敲低MELLT14后促进结直肠癌进展。
总结:无。
图3.  上调MELLT14抑制CRC细胞增殖。
与图2类似,图2是抑制MELLT14表达,图3就是说明过表达MELLT14抑制CRC进展。
总结:无。
图4.  MELLT14抑制CRC细胞迁移和侵袭。
图4 就是将前面的增殖表型换成了Migration和Invasion这两个实验。
总结:无。
图5.  MELLT14在裸鼠中发挥抑癌作用。
图5 结果和前面一致。
总结:无。
中期总结:全文共8个图,前5个图主要讲了两件事:
1. MELLT14在CRC组织和细胞中低表达且与患者预后良好有关。
2. MELLT14在体内外发挥抑癌作用。
接下来终于到了m6A如何和miRNA结合起来的,也是本文的重点。作者前期已经确定了作为m6A writer的MELLT14在CRC中发挥抑癌作用,接下来要探索METTL14调节的潜在下游miRNA。
想了解图6需要学习一下其他的知识,如miRNA 的成熟加工过程:
EGCR8作为Drosha的主要结合蛋白,可以通过其C末端的两个双链RNA结合区域与pri-miRNA结合,招募并指导Drosha在pri-miRNA的正确位置剪切,生成pre-miRNA,pre-miRNA进一步被Dicer酶加工剪切,形成成熟的miRNA。
我猜这个作者团队是学的这篇论文的思路PMID :25799998。这篇文献报道m6A修饰可加速pri-miRNA 的成熟。
 
图6.  METTL14通过 m6A甲基化通过DGCR8影响miR-375的成熟。
图6 A:通过LinkedOmics database数据库分析发现与METTL14表达呈正相关的9个 miRNA。
图6 B:验证全部miRNA是否与METTL14表达呈正相关,敲低METTL14表达后只有miRNA-375和miR-200a表达下调,其余7个miRNA无差异表达。
图6 C:过表达和敲低METTL14后,miRNA-375和miR-200a表达分别上调和下调。
图6 D:过表达和敲低METTL14后,primiRNA-375表达有改变(总之就是和miRNA-375变化趋势相反),primiRNA-200a表达无改变。作者选择miR-375进行后续深入研究。
图6 E:之前有文献报道m6A修饰可促进primiRNA成熟,经生信预测primiRNA-375存在一个潜在可发生m6A修饰的A,将此位点突变为T后,成熟的miRNA-375表达降低。这些数据说明primiRNA-375的位点A可能存在m6A修饰,且此修饰促进primiRNA-375成熟,增加了miR-375表达。
图6 F:做RIP实验(IP抗体为DGCR8)。与对照组相比,转染METTL14组后。DGCR8蛋白富集到的primiRNA-375显著提高。意味着有更多的primiRNA-375被DGCR8加工成miR-375。和图6 C和图6 D的结果一致拉。
图6 G:做MeRIP实验(IP抗体为m6A)。与对照组相比,转染METTL14组的primiRNA-375的m6A修饰水平显著提高。
总结:这块是文章的重点这块的理解需要学一下miRNA从primiRNA到成熟miRNA 的加工过程。我之前也不是很熟悉这块,也是现学现卖,如果哪里讲的不对请指正。我的经历告诉小伙伴们我们学习文献不可能啥都会,很多时候需要自己先查一些知识来理解文献的思路。基本上这个文章把这个图学会了就是成功,其他图都是传统的套路。
图7 .  METTL14通过影响miR-375发挥抑癌作用。
图7 A-C:miR-375在患者组织较正常组织低表达;高表达miR-375的患者预后良好;METTL14和miR-375呈正相关。
图7 D-M:METTL14通过影响miR-375发挥抑癌作用。
总结:无。
很多其他文献报道了miR-375的靶基因包括YAP1,SP1,AEG1, PDK1, IGF1R和JAK2等基因。作者想探索METTL14是否影响miR-375下游靶基因的表达。
 
图8. METTL14通过miR-375/YAP1 and miR-375/SP1 通路在CRC中发挥抑癌作用。
图8 A:qPCR检测结果提示METTL14过表达后促进miR-375表达。
图8 B:WB检测结果提示METTL14抑制miR-375下游靶基因YAP1和SP1的表达。
图8 C:将之前裸鼠成瘤实验中的组织包成蜡块,shMETTL14组较shNC组中的YAP1和SP1表达高,过表达组反之亦然。
图8 D:验证了其他文献中报道的miR-375可抑制YAP1和SP1的表达。
图8 E:对图8 A的回复实验。
图8 F-I:METTL14通过miR-375/YAP1 and miR-375/SP1 通路在CRC中发挥抑癌作用。
总结:无。
不足:这个图的给我的感觉就是凑数,做的不认真哈。应该单独做一做过表达和敲低后YAP1和SP1对CRC表型的影响。miR-375通过YAP1和SP1影响CRC表型。最后再做METTL14通过YAP1和SP1影响CRC表型是不是更好。
全文总结:
选择此论文原因:
我认识的很多人在过去10年都研究过miRNA。这些人大部分都转向了LncRNA和circRNA的研究。2015-2018年期间有些小伙伴及时转向了LncRNA和circRNA的ceRNA机制,大多数人都中了有关ceRNA机制的国自然。但是2020年再做ceRNA机制就不太合适拉,可以将过去的miRNA和外泌体、可变剪接等方向结合,当然m6A也是一个不错的思路。我讲此文仅希望给大家提供一个潜在思路。
 
我学到的知识:
1. 整体来说,文章的配色不错,值得学习。
2. 这篇文章严格意义上讲是一篇涉及两个主变量的文章,两个主变量分别为METTL14和miR-375。第一个主角METTL14就是硬靠。我不建议这样做,这样的做法现在能发8分,以后5分都够呛。第二个主角miR-375是公开数据库的生信分析+低通量验证,这个思路值得学习。
3. 表型检测最好是过表达和敲低都做,这篇文章做的很好。
4. 检测上游基因是否影响下游基因(如YAP1,E-cad等)的表达很有必要,毕竟很多下游基因编码的蛋白是真正发挥作用影响疾病表型的。
其他感受:
1. 这篇文章看起来不太难,但是人家就在2020年2月发表在了8分多的杂志上。为什么思路不难的文章也能发高分?
我的理解:本文之所以能发8分多,就是因为作者研究的是热点m6A,我两三个月前真看过一篇工作量相当的关于细胞周期研究的文章,也是8个图只发了3.8分,这就是蹭热点的重要性。这提示我们今后做研究尽量早点结合热点,行动晚了就不好说了,而且后做的门槛会越来越高。我们写基金也不能盲目追热点,没有前期基础也很难中标的。
2. 我们不应该盲目追求一个文章涉及多个指标的间接作用,例如A-B-C-D-E信号通路影响某疾病的某表型,然后每个环节都做的不细致。我们应该立足两三个指标,把每个指标的具体功能和两两之间的关系作完整做细致。这篇8分文章在这方面做的很好,值得我们学习。
3. 截止目前,miRNA和m6A结合起来研究的文章不太多,我目前没查到5篇,南京医大很多团队偏爱这个方向哈,我本来打算讲另一篇同样来自南京医科大学的论文(PMID:31228940),有感兴趣的小伙伴可以自己读一读。
部分miRNA和m6A结合相关的国自然基金名称:
1. ALKBH5调控Pri-miR-21的m6A甲基化促进胰腺癌化疗敏感性的机制研究(上海交通大学,2018年)
2. METTL3通过介导pri-miR-145的m6A甲基化抑制肾癌恶性进展的机制研究(南京医科大学,2017年)
3. METTL14通过介导pri-miR-17的m6A修饰促进心肌梗死后心肌细胞增殖的机制研究(南京医科大学,2018年)
 
以上就是关于miRNA与m6A研究结合的文献分享,希望对大家有所帮助。
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2 条回复 A文章作者 M管理员
  1. 想要这个的论文

    • 文章标题文中都提到了,pubmed上可以直接搜索

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