10X Genomics V(D)J测序:免疫分析从零起步学(1)

本碎嘴子小编好久没和大家见面了,真的是非常想念大家!~

疫情平稳之后,全面复工的小编临危受命,接下了和新冠有关的一个分析工作。所以,苦命的我再一次,又一次,一次又一次,要在完全没有经验的领域里从零起步学。此前小编从来没有接触过免疫学相关分析,这次把最近一个月恶补的知识和技术跟大家做个分享。这次的分享不走段子手风格了,本期的我只是一个莫得感情的科普机器。

今天的分享先讲10X Genomics V(D)J 测序的原理和流程,数据和结果分析我们下一次再讲。

准备好了那咱就开始吧!~

首先,V(D)J测序测得是什么呢?顾名思义,测得是V,D和J基因。VDJ基因是编码生成BCR和TCR的基因。BCR和TCR,是B(T) Cell Receptor的缩写,是一种长在B或T细胞表面的免疫球蛋白,其作用是识别抗原,接收抗原刺激。其中,BCR由重链和轻链组成,TCR由α和β链组成。这里我讲的时候,以BCR为例。TCR类似。

每一个BCR,包含两条重链和两条轻链。其中重链由一个可变区(V区)和三个恒定区(C区)组成,轻链则包含一个可变区与一个恒定区。重链的恒定区,决定了BCR的免疫原性,即决定了它属于5类免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM、IgD、IgE)中的哪一种。而轻链的恒定区,则决定了搭配的轻链种类(k或入型)。而可变区(V区)则决定了它的特异性,即决定了它能和什么样的抗原结合

轻重链的每种基因片段以多拷贝形式存在,这些基因片段之间被大小不同的基因隔开,每个基因片段都能编码一段蛋白,只有通过基因重组使这些基因片段发生重排和组合,才能形成有功能的BCR。如果把VDJ基因理解成麻将里的万字、筒和条子,就好理解多了。重组酶的作用,就是每次从每一类的所有牌中抽出来几张,最后拼在一起。使得最后成熟的每个B细胞克隆都只含有一个V片段,一个D片段(轻链没有),和一个J片段,且只有一种L-VJC/H-VDJC组合,编码一种BCR。

这种重排机制,对于免疫系统有着重要的意义。通过基因片段的随机重排,才能够生成数量非常庞大的各不相同的BCR或TCR,来应对不同的抗原。BCR在后期还有体细胞高频突变机制,能进一步扩充BCR库的数量,这个我们下一次再细讲。

好的,现在大家明白了VDJ基因是什么。那么接下来开始说10X Genomics如何对VDJ基因进行测序,来完成对样本的免疫学层面的分析。

10X系统的单细胞测序技术,已经发展的非常完善了。尤其是转录组,从建库到测序的过程,已经有无数的文章和博客分享过了,这里我就不赘述了。它的免疫层面分析,是在转录组测序的基础上,增加了对VDJ基因片段的测序。
首先,细胞和酶会结合凝胶珠然后包裹在油滴中,完成反转录并连接barcode来标记每一个单细胞。

在完成反转录和barcode连接之后,凝胶珠破裂,所有细胞的cDNA混合在一起。

cDNA被分为两部分,一部分正常建库用于后续转录组测序。而另一部分则通过巢式PCR,有针对性的富集VDJ基因编码区域。

简单说一下巢式PCR。这种技术是通过改变引物来达到特异性高精度富集某一个片段的目的。换成人话来说,就是如果第一次扩增用的引物特异性不够,会结合到除了目标序列之外的序列,那么第二次的引物,是第一次引物相邻的序列,如果匹配错了,那第二次扩增的引物也能结合上的概率微乎其微。这样就能保证PCR扩增的正确性。

所以,依据这样的原理,根据VDJ基因旁边编码恒定C区的基因非常保守的原则,将C区的序列设计为引物,每一轮的引物依次向两边来回变换,这样就能保证正确富集含有VDJ区域的基因了。

VDJ测序片段的组成——从左到右(5’~3’)分别是:

IlluminaP5接头、P5测序引物(黑色Read1处)16bp10x™Barcode、10bp UMI、13bp Template Switch oligo(TSO)序列、插入cDNA片段、P7测序引物(黑色Read2处)、样本Index(i7-indexread)、IlluminaP7接头。
通过建库,PCR扩增,上机测序等步骤,10X系统完成了对样本中存在的VDJ基因重排信息的捕捉,以便查看样本的BCR或TCR丰度和多样性。
OK,本期分享就先到这里。关于测序结果形式和解读等问题,我们下一次再聊~
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