单细胞测序挖掘探索癌症免疫抑制和预后差的根源(生信挖掘篇)

当提到单细胞测序,第一反应:太贵,烧钱;再提到公共数据库,不好发文章。在此,大师姐要跟大家说,其实公共数据的挖掘不仅是寻找科研思路的重要手段也能发高分。其实在科研道路上不缺乏数据,最缺乏的是ideal。不信大家来看看,人家是如何通过公共数据库中的数据完美演绎出影响因子高达8.402分的文章。
 
1. 引言
在这篇文章中作者主要通过单细胞测序数据揭示肾透明细胞癌(ccRCC)中瘤内异质性导致的肿瘤预后差及免疫抑制的根本原因。文中不仅揭示了巨噬细胞M2极化是导致肿瘤免疫抑制和预后差的主要原因,还重点解释了CD8+T细胞耗竭也是肿瘤恶化和进展的主要因素。现在来看看文章的整体思路:
 
2. 数据来源
(1) 单细胞测序数据:来自3个病例的21个样本(12个肿瘤样本和9个对照样本)
(2) TCGA数据库中的肾透明细胞癌(TCGA_KIRC),包含533例肿瘤样本和72例正常样本
3. 结果展示
1)单细胞测序数据的质控和细胞群分类
作者通过对单细胞测序数据进行质控后,获得24550个细胞,其中7786个细胞来源于正常组织,16764个细胞来源于肿瘤组织。随后通过cell marker数据库对其进行注释,最后筛选到了15种细胞类型(癌细胞、9种免疫细胞及5种非免疫细胞),为了揭示瘤内异质性,又针对这15类型细胞进一步细分,共分选出39种细胞亚型(21种非免疫细胞簇,18种免疫细胞簇)。
通过对TCGA数据库肾透明细胞癌(TCGA-KIRC)进行差异分析发现,ALDOB,MT1G,GPX3,MIOX基因在正常组织中高表达,在癌组织中基本不表达,由此提出,以上基因的异常表达可能是ccRCC的风险信号。此外还发现,ccRCC具有独特的糖酵解代谢模式。结果如下图所示:

2) 巨噬细胞在ccRCC肿瘤微环境中占重要位置且趋向M2极化
作者为了探讨肿瘤微环境中细胞间的相互作用关系,通过CellphoneDB数据库分析潜在的受体-配体对并构建相互作用网络,结果发现巨噬细胞与其他细胞类型的互作关系对最多,由此说明,巨噬细胞是ccRCC肿瘤微环境中重要的免疫细胞类群。
为了研究瘤内异质性,针对3698个巨噬细胞进一步分类,共分成了4簇细胞群(4类亚型);经对该类群进行免疫荧光染色验证发现,具有M2极化的标记物(CD68 CD163TREM2TAMsVEGFA)在cluster1中均高表达(证据1);scRNA-seq分析发现,TREM2仅在cluster1中存在(证据2);最后通过TCGA-KIRC测序数据分析TREM2与M2极化标记物之间的相关性,结果发现相关系数均大于0.5(证据3)由此说明,该细胞簇极有可能为M2极化的巨噬细胞群。
为了揭示cluster1巨噬细胞簇的功能,通过免疫检查点的分析和验证,发现CD274(PD-L1)和PDCD1LG2(PD-L2)在cluster1中的表达相对较高。据报道,这些分子可以通过与CD8+T细胞表面的受体PD-1结合来抑制CD8+T细胞的活性。由于所有这些免疫抑制配体都能抑制细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的功能,这一证据证明了cluster1巨噬细胞的免疫抑制特性增强。GSVA分析结果发现cluster1中的基因在补体和干扰素(IFN)通路中显著上调,炎症通路下调。种种的证据说明了,cluster1为M2巨噬细胞类群,且具有促进肾透明细胞癌的发展和恶化。
结论:肿瘤微环境中的巨噬细胞M2极化是肾透明细胞癌预后差和免疫抑制的重要原因。 

3)ccRCC 肿瘤微环境中CD8+T细胞趋向耗竭
揭示完巨噬细胞,作者发现T细胞也是肿瘤微环境中重要的免疫细胞类型,通过将5108个CD8+T细胞分为了四种细胞簇亚型,其中cluster2主要来源于正常组织,而cluster1,cluster3,cluster4来源于肿瘤组织。
随后,作者通过免疫检查点验证分析发现抑制性检查点,包括HAVCR2(TIM3)、LAG3、PDCD1(PD-1)、TIGIT、CD27、CTLA-4和TNFRSF9(T细胞衰竭的标志物),在cluster4细胞簇中上调,这些数据表明cluster4细胞在TME中趋向耗竭。
为了验证这一现象,作者通过组织芯片进行了免疫荧光检测,该基因在CD8+T细胞在肿瘤组织中高度表达。此外,LAG3和HAVCR2在大多数肿瘤浸润CD8+T细胞中高表达(图3D和3E)。目前,PD-1/PD-L1和CTLA-4是最受欢迎的免疫治疗靶点。由于LAG3和HAVCR2在这个耗竭的T细胞亚群中的表达明显高于PD-1,研究表明LAG3和HAVCR2可能是ccRCC免疫治疗的较好靶点。
为了观察T细胞衰竭的过程(时间轨迹),作者通过拟时分析发现,来自正常组织的cluster2 CD8+T细胞倾向于转化为肿瘤浸润性T细胞亚群。此外,在分化轨迹的末端出现了代表耗竭的T细胞簇(cluster4), 在这个过程中,T细胞衰竭相关的免疫检查点(PD-1、CTLA-4、LAG3、TIM3、TNFRSF9、TIGIT)倾向于上调,而增效检查点(CD226、CD7)倾向于下调(图1G)。免疫检查点分析,细胞分化轨迹分析,功能富集分析均说明了CD8+T细胞在ccRCC早期被激活,持续抗原刺激后,活化的CD8+T细胞趋向耗竭,DNA甲基化可能在这一过程中起重要作用。
SCENIC分析发现,转录因子STAT3T及HIVEP、NFAT等调控的基因在耗竭CD8+T细胞中上调表达,这一结果为识别ccRCC特异性T细胞功能障碍的新候选转录因子提供了线索。
结论:CD8+T细胞耗竭与肿瘤进展和预后差息息相关。

4)ccRCC癌细胞代谢异常
作者通过分析癌细胞和肾小管细胞的差异表达基因和功能富集发现,如图4B所示,缺氧反应、免疫抑制、脂质合成在癌细胞中显著富集,脂质分解被抑制,结果与前期研究发现ccRCC组织和细胞系中脂滴的异常聚集相一致。有助于解释在肿瘤微环境中,免疫细胞对肿瘤的免疫抑制作用。PPAR通路的异常变化是ccRCC代谢异常的主要特征。
此外发现,STAT3通路在癌症中上调,STAT3不仅参与巨噬细胞向M2极化还参与T细胞的耗竭,从而说明STAT3抑制可作为治疗ccRCC的一种新的治疗策略。

5)  肌成纤维细胞在ccRCC肿瘤微环境中显著富集且异质化
经分析发现,如图5A所示,大多数成纤维细胞来自肿瘤组织。这些肌纤维母细胞聚集成3亚型(cluster1,PDGFRB+FABP5+CEBPB+;cluster3,NNMT+IL32+COL1A1+;cluster,无标记物)(图5C)。有趣的是,如图5C所示,FABP5几乎只在成纤维细胞中表达。此外,CEBPB还与脂质代谢有关。这些数据显示,异常的脂质代谢不仅可能发生在癌细胞中,也可能发生在肿瘤相关成纤维细胞中。
此外,作者还发现不同内皮细胞亚型具有表现出了不同的功能,肿瘤来源的内皮细胞cluster1和cluster 6,GSVA分析结果揭示两种细胞亚型表现出不同的功能,cluster6高增殖、炎症反应明显及参与ccRCC的免疫抑制浸润;而,cluster1炎症反应受抑制。

 

6)  肿瘤免疫细胞浸润与ccRCC预后不良相关
首先,作者通过TCGA-KIRC数据库中分析各类细胞亚群的相对丰度,以探讨本研究中检测到的细胞簇的临床价值(图S7A)。如图6A和6B所示,四个细胞簇(癌细胞cluster4、CD8+T cluster4、内皮细胞cluster 6、成纤维细胞cluster 3)与低总生存率(OS)和无病生存率(DFS)相关(p<0.05)。
此外,CD8 T Cell cluster 4和Macroophage cluster1 预后差,及CD8+ T Cell cluster 4在高级别及肿瘤后期中表达丰度高,提示T细胞耗竭与ccRCC进展相关。 
最后,为了进一步研究免疫浸润的临床价值,作者通过consults ClusterPlus30将533例ccRCC患者分为三种不同的免疫亚型(图6E)。与第1组和第3组患者相比,第2组患者的预后明显较差(图6F)。有趣的是,我们注意到CD8+T细胞簇3和4表现出最大的差异,因为CD8+T细胞簇3的比例降低,而CD8+T细胞簇4在簇3患者中富集(图6G和6H)。
结论:这些数据进一步证明了T细胞衰竭在ccRCC进展中的关键作用。因此,阻断参与这一过程的免疫检查站可能成为ccRCC治疗和药物发现的有利靶点。 

7) 总结
(1)从单细胞层面探究了ccRCC肿瘤微环境中细胞的异质性,及重要细胞亚型的预后状况。最终发现,T细胞耗竭是ccRCC免疫抑制特性的关键因素且与不良预后相关,参与肿瘤进展。
(2)鉴定了免疫治疗新靶点。
(3)进一步揭示了T细胞耗竭在ccRCC中的关键作用,阻断该过程靶基因有望成为治疗ccRCC的药物靶点。
文献解读

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