技术进步:多片段Gibson Assembly的优化

把各种线性DNA分子组装在一起是分子生物学实验中不可或缺的部分。人们一般依赖于限制性内切酶和DNA连接酶来完成这些操作,如把一段DNA插入到质粒中【1】。由J. Craig Venter Institute的Daniel Gibson等人在2009年发明的Gibson Assembly则不需要用上述的“剪切/粘贴”的方法【2】。无论DNA片段的长度如何,在三种酶的介导下,多个片段可在单一反应中连接成完整的双链DNA分子。Gibson Assembly被证明是一种高效组装质粒的方法,在全世界范围内得到广泛使用。

首先,两端有同源部分的DNA片段在T5外切酶的作用下,3’同源部分被暴露出来,互相进行配对重组。然后,DNA聚合酶会把缺口补齐。最后在DNA连接酶的作用下,单链裂口得到了修复(见下图)。但是,Gibson Assembly并不完美,多片段(超过5个)组装的效率和精确度还有待提高。T5外切酶有单链内切酶的活性,会破坏3’端的同源臂,导致3’端单链部分的破坏,影响片段的重组【3】

Gibson Assembly的三个步骤

2020年6月15日,哈佛医学院的Constance Cepko实验室在bioRxiv 发布了题为A Simple Enhancement for Gibson Isothermal Assembly的论文,通过向反应体系添加一种单链DNA结合蛋白,抑制了T5外切酶对3’端的破坏,减少了3’端二级结构的形成,提高了Gibson Assembly的效率和精确度。

作者用pUC19质粒进行两片段或六片段的Gibson Assembly,然后转化大肠杆菌。如果两片段的Assembly成功,转化后的大肠杆菌会表达绿色荧光蛋白;如果六片段的Assembly成功则同时表达绿色和红色荧光蛋白(见下图)

Assembly反应的实验设计

与传统Gibson Assembly和New England Biolabs的HiFi DNA Assembly Master Mix(NEB E2621)相比,添加了单链DNA结合蛋白(NEB M2401S)的Gibson Assembly效率和准确度更高(见下图)进行多片段Gibson Assembly时,这种差异更加明显。

反应结果的量化比较

这种单链DNA结合蛋白的作用机制尚不明确。它或许可以保护单链DNA免受内切酶的攻击,并且促进单链间的杂交。这种改进非常简便且成本较低,有助于解决多片段Gibson Assembly成功率低的难题。

单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA-binding protein,SSB)的作用机制
原文链接:https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.06.14.150979v1.full

1. Cohen, S.N., et al., Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A, 1973. 70(11): p. 3240-4.

2. Gibson, D.G., et al., Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods, 2009. 6(5): p. 343-5.

3. Sayers, J.R. and F. Eckstein, A single-strand specific endonuclease activity copurifies with overexpressed T5 D15 exonuclease. Nucleic Acids Res, 1991. 19(15): p. 4127-32.

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