研究热点:RNA结合蛋白(RBP)

神经母细胞瘤是由未分化的神经母细胞构成的肿瘤,是婴幼儿最常见的肿瘤。由于转移性强,预后较差,并且发病机制多样等原因一直成为肿瘤领域中的难题。RNA结合蛋白(RBP)顾名思义是可以与RNA相互结合的蛋白质,在生物体中大部分的RNA都要与蛋白质相结合,在RNA合成修饰转运等方面发挥作用,已经有许多RBP被报道在促进癌症的发展过程中起着重要的作用。
今天小编为大家带来的就是一篇关于RBP在肿瘤中发挥作用的文章。这篇文章于2020年4月发表在Neoplasia上,对于要研究肿瘤和RBP的小伙伴可以通过这篇文章梳理思路,说不定可以蹭上RBP热点轻松毕业啊。
 

1. LIN28b促进神经母细胞瘤转移
已有报道表明LIN28b作为一种RNA结合蛋白,在神经母细胞瘤亚型中高表达,并且这种表达与较高分期的神经母细胞瘤和较差预后相关。
作者首先构建了低表达Lin28b的细胞株,并进行了mRNA和蛋白的验证,将对照和敲降Lin28b的细胞系注射到NSG小鼠的尾静脉来研究神经母细胞瘤转移。结果可以看到Lin28b敲降后肿瘤细胞转移生长速度较慢,荷瘤小鼠生存期更长。
结论:Lin28b在体内环境下促进了神经母细胞瘤的转移,Lin28b的缺失减少了肿瘤的扩散,显著延长了生存期。

2. LIN28B积极影响神经母细胞瘤的自我更新
已经有研究表明Lin28b促进细胞增殖,随后作者检测Lin28b对肿瘤自我更新的影响。利用肿瘤干性成球实验在非贴壁、无血清条件下培养,形成肿瘤球体。相比于对照,敲降Lin28b的细胞观察到自我更新因子NANOG、OCT4、SOX2和Nestin的mRNA和蛋白质水平下降。作者又进一步将原本高表Lin28b的三种神经母细胞瘤细胞系中的Lin28b敲降,进行成瘤实验,结果发现所有细胞系的自我更新都受到抑制。
结论:Lin28b对自我更新基因的影响表明Lin28b促进肿瘤细胞自我更新。’

3. LIN28b促进神经母细胞瘤细胞迁移
转移细胞的一个关键特性是较强的迁移能力。作者利用划痕实验观察到Lin28b促进神经母细胞瘤迁移,并且在24小时内细胞数量并无明显差异。为了进一步说明问题,作者用丝裂霉素C处理细胞抑制其增殖,表明Lin28b对增殖的影响不会干扰细胞迁移。
结论:Lin28b促进了神经母细胞瘤的迁移,并且不受细胞增殖的影响。

 
4. LET-7I抑制神经母细胞瘤的自我更新和迁移
已有研究报道Lin28b可以抑制let-7microRNAs的成熟和加工,并且Lin28b对神经母细胞瘤中的let-7家族成员LET-7I可以负调节。作者首先建立了过表达let-7i的神经母细胞瘤细胞系,并证实let-7i过表达。类似于Lin28b的耗尽,let-7i的过表达导致神经母细胞瘤的自我更新和迁移的显著减少。

5. PDZ结合激酶是一种受Lin28b影响的新激酶
接下来作者想要寻找可能具有治疗靶向性的受Lin28b影响的新基因。通过干扰LIN28b水平并研究对形成恶性表型的候选激酶的影响。作者选取了与Lin28b的高表达显著正相关前10个激酶并重点研究PDZ结合激酶(Pbk)。首先Lin28b和PBK在神经母细胞瘤中的表达呈正相关,在其他神经母细胞瘤数据集中Lin28b-PBK的相关性也得到验证。PBK的高表达与较高分期的神经母细胞瘤相关且有较低的总存活率。虽然这些数据证明了Lin28b和PBK表达之间的相关性,但它们并没有证明Lin28b是否影响PBK的表达。作者在原本高表Lin28b的细胞系中耗尽了Lin28b,发现PBK的水平也有所降低。
结论:表明Lin28b促进了PBK的表达,并可能促进神经母细胞瘤中的致癌作用。

6. 两个神经母细胞瘤基因Lin28b和MYCN调节PBK的表达
接下来,作者解析了Lin28b影响PBK表达的机制。利用之前构建的let-7i过表细胞系,发现let7i表达下调PBK。经过数据库预测PBK在其3’UTR中有一个let-7结合位点,之后作者进行了荧光素酶报告实验,结果表明LET-7I处理抑制了PBK 3’UTR驱动的荧光素酶活性。突变PBK的3’UTR中的let-7结合位点,发现let-7i的抑制作用被减轻。
有报道表明MYC通过与其启动子结合来正向调节PBK的表达,由于MYCN和MYC有许多相同的转录靶点,并且观察到MYCN和PBK在神经母细胞瘤中的表达呈正相关。所以作者猜想MYCN可能直接调节PBK的表达。作者首先敲降了MYCN,并用Wb验证,MYCN的缺失导致PBK mRNA和蛋白水平降低。随后ChIP-Seq数据分析表明,MYCN与PBK启动子结合,表明MYCN直接转录上调PBK。荧光素酶实验表明MYCN促进PBK驱动的荧光素酶活性。
结论:Lin28b/let-7直接负调控PBK,而MYCN会正向调控PBK的表达。

7. PBK缺失影响神经母细胞瘤的表型
作者将神经母细胞瘤细胞系中的PBK敲降,观察到与Lin28b敲降类似的表型,PBK耗竭导致肿瘤细胞增殖、自我更新和细胞迁移减少,验证了Lin28b调节PBK的表型研究。
结论:PBK敲降后与lin28b缺失的作用相似,抑制了神经母细胞瘤的增殖、自我更新和迁移。

研究思路:

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2020-8-10 21:17:04

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