Western Blot技术及常见问题分析

Western blot基本原理

Western Blot,通常我们在日常交流中说的就是简称“WB”,中文名称是“蛋白印迹”或“免疫印迹”,其核心本质是抗原抗体的特异性反应。Western Blot的基本原理是蛋白质通过凝胶电泳后,按分子量大小顺序在分离胶中分离开来,通过转膜可将胶上蛋白质转移到固相载体(通常是PVDF膜、NC膜和尼龙膜)表面,然后加入一抗去特异性结合膜上蛋白质,再加入酶或者荧光素标记的二抗,二抗与一抗结合反应后,通过底物显色、化学发光等方法检测目的蛋白。Western Blot实验一般用来判断特定蛋白在样本中是否表达及粗略分析特定蛋白表达量的高低。

Western Blot 优点

分辨率的电泳技术

特异敏感的抗原-抗体反应
1-5 ng 中等大小的靶蛋白
Western Blot 结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种优点,可检测到低至 1~5 ng(最低可到 10~100 pg)中等大小的靶蛋白。

 Western Blot 应用

Western Western目的蛋白的表达特性分析

目的蛋白与其它蛋白的互作

目的蛋白的组织定位

目的蛋白的表达量分析

Western Blot实验试剂及仪器

1.试剂准备

(1)甲醇

(2)转移缓冲液(Tris5.8g 甘氨酸2.9g SDS 0.37g 甲醇200ml V=1L)

(3)一抗,二抗

(4)PBST,PBS,Tween-20

(5)显影液(5X):

自来水(加热至50℃)375ml(以下药品加到温水中)米吐尔1.55g,亚硫酸钠(无水)22.5g,碳酸钠(无水)33.75g,溴化钾 20.95g,补水至 500ml

(6)定影液:

自来水(50~60℃) 700ml (以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者)硫代硫酸钠 240g, 亚硫酸钠(无水) 15g, 冰乙酸 12.6ml,硼酸 7.5g,钾明矾 15g(水冷至 30℃以下时再加入),加水定容至 1000ml,室温保存

2. 材料准备

转膜用的夹子,两块海绵垫,一支滴管,两张滤纸,一张PVDF膜,转膜槽,转移电泳仪,摇床,计时器,磁力搅拌器,转子,Western blot 盒,一块SDS-PAGE胶,脱脂奶粉

实验步骤

蛋白样品的制备

1.水溶液提取法:稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解 度大,是提取蛋白质最常用的的溶剂,操作相对麻烦,重复性一般;

2. 有机溶剂提取法;

3. 离心管柱提取法:超快速,易用,高产及重复性强;

4. 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白。

Western blot注意事项和常见问题

❶为什么检测结果有很多杂带?

1.可能是样品本身体内表达的蛋白具有多种修饰形式如糖基化、磷酸化、乙酰化等。
2.若是细胞样品,可能是细胞传代次数过多,使其蛋白表达不同,可以使用传达次数少的进行平行实验一起做对照看看。
3.蛋白降解,导致蛋白分子量降低。
4.蛋白形成多聚体形式。

❷转膜过程中的注意事项:

转膜方法可分为湿转法和半干法。需要注意:

1.Transfer buffer一定要配制正确,并且务必要分清running buffer 和transfer buffer。一个简便区分办法,transfer buffer里没有SDS,转膜时没有气泡。
2.转膜时务必要夹紧夹板,可采用“三明治”型滤纸加海绵结构(下图),要拧紧一点。可以增加海绵的厚度,也可以多加两块海绵,但是多加滤纸的时候要小心,因为不同滤纸的质地和材质不一样,可能会导致电阻比较大,需要延长转膜时间才可以(这个需要前期摸索,在增加滤纸之前要去网上查一下)。

 Western blot转膜“三明治”

3.夹三明治转膜结构的时候可以多加transfer buffer,要没过胶和膜,这样有助于减少气泡,提高转膜效率。
4.注意转膜温度的控制,可以提前将transfer buffer放到4 ℃冰箱,等到用的时候取出来。转膜过程中,尤其是高电流快速转膜时,通常会有非常严重的发热现象,需要在转膜盒外围加冰水混合物。如果觉得天气太热冰容易融化的话,还可以放冻好的冰袋,一般这样就可以保证转膜的时候transfer buffer不会发烫。
5.配置转膜液的时候,记住甲醇浓度20%
6.胶在负极,膜靠近正极;转膜的时候,海绵要比滤纸大,滤纸要比胶块大,PVDF膜或硝酸纤维素NC膜要比胶块大,但都不要超过海绵;比对胶块中上样顺序,在膜上做好标记,便于后续分析结果。
7.注意一定要戴手套或塑料镊子接触膜,避免手上的蛋白和油脂降低转膜效率。
8.对于湿转法:一般转膜的电流在200mA-400 mA之间,转膜时间为30-60 分钟。也可以在15-20 mA电流中转膜过夜。大片段的>50 KD的可以选用350 mA电流,小片段的可以用250 mA。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的转膜时间越长,目的蛋白的分子量越小,需要的转膜时间越短。

 

❸大分子量蛋白200KD,在做western要注意什么呢?

做200kd蛋白的Western Blot时要注意,分离胶最好选择>7%的;剥胶时要小心;转移时间需要相应延长;要做分子量参照(否则出现杂带不知道如何分析)
 
❹ 蛋白变性后可以存放多久?

-80℃,一两年没有问题。最关键两条:不要被蛋白酶水解掉;不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。

❺电泳中的问题   
出现问题 原因
条带呈笑脸状 (︶) 凝胶不均匀冷却,中间冷却不好;迁移过快,电泳系统温度偏高。
条带呈皱眉状 (︵) 可能是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡,或者凝胶两边聚合不完全。
拖尾 样品溶解不好。
纹理(纵向条纹) 样品中含有不溶性颗粒,电泳前将样品离心去除颗粒。
条带偏斜 电极不平衡或者加样位置偏斜。
条带两边扩散 加样量过多。

❻Western blot 结果中背景 

可能的原因 建议
抗体浓度太高 一抗或二抗浓度太高会导致高背景,增加抗体稀释倍数。
一抗孵育的温度偏高 建议 4℃ 结合过夜。
使用的封闭液不兼容 对比不同的封闭缓冲液。
非特异性位点封闭不足 优化封闭缓冲液,最好的封闭缓冲液具有系统依赖性;提高封闭液中蛋白的浓度;
优化封闭时间和/或温度;
室温封闭至少 1 h 或者 4°C 封闭过夜;
在封闭液中加入 Tween-20,Tween-20 的终浓度为 0.05%。
封闭液中与其它蛋白发生抗体的交叉反应 换一种不同的封闭液;
不要用含抗生素蛋白的牛奶封闭,牛奶含生物素;
交叉反应的检测:封闭一张干净的膜,与抗体一起孵育,然后用超感应化学发光底物检测。
缓冲液污染或结块沉淀 制备新的缓冲液。
洗膜不充分 降低 HRP 结合物的浓度;
增加洗涤次数和使用洗膜缓冲液的体积;
如果洗涤液中无 Tween-20,添加 Tween-20 使其终浓度为 0.05%。
膜在实验过程中干过 实验过程中要注意保持膜的湿润。
选择的膜容易产生高背景 一般硝酸纤维素膜(NC)的背景会比 PVDF 膜低。
膜的曝光时间过久 缩短印迹膜曝光到胶片的时间;
在孵育过程中始终进行震荡。
膜被污染 小心夹膜——损坏膜可能导致非特异性结合;

不能空手持膜,始终带干净手套或用镊子。

HRP 处产生聚集体 用 0.2μm 过滤器过滤结合物。
结合可产生斑点
用一种新的高质量的结合物。
缓冲液中有污染 使用新的缓冲液;
缓冲液使用前过滤。
操作设备被污染
保证电泳仪器、印迹仪器和孵育用容器清洁,无外缘污染物;
保证在转膜后没有凝胶留在膜上,蛋白可能黏在胶上导致背景。

❼ 条带弱 

 

原因分析1:抗原量不足;
解决方案1样前做蛋白定量,增大上样量;

蛋白定量的意义:保证各处理组总蛋白上样量一致,蛋白总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴定,蛋白含量太高会使条带扭曲,影响电泳的分辨力;

原因分析2:蛋白质储存过程中降解;

解决方案2:重新制备样品;

原因分析3:膜错误选择,转膜不完全;
解决方案3:选择合适的转印膜:大蛋白(>20KDa)选大孔膜(0.45μm),小蛋白(<20KDa)选小孔膜(0.2μm);优化转膜条件、时间、电压。
原因分析4:抗体量不足
解决方案4:增加抗体浓度,注意抗体储存条件(避免反复冻融);

❽条带弯曲 

原因分析1:条带向上弯曲(︶ 条带呈笑脸状)
解决方案1分离胶配好后用水压线,保证水平,配胶缓冲液现用现配,混合均匀后制胶。

原因分析2:条带向下弯曲(︵ 条带呈皱眉状)

解决方案2制胶架装配好后,用水检查是否有空隙再灌胶。

原因分析3:条带显示不均匀,中空:可能凝固太快导致聚合不均匀;

解决方案3使用合适的促凝剂,制胶液混合好后及时灌胶

❾ 其它问题

1.反白现象
反白现象是蛋白条带中间空白,而周围背景正常,如图4-18所示。该现象可能原因是一抗浓度过高,二抗上HRP催化活力太强,同时显色底物处于临界点,反应时间不长,将周围底物催化完,形成了空白。可降低一抗和二抗浓度,或者更换底物来避免该现象。
2.条带中间或周围出现白圈

条带中间白圈(如图4-19)可能是由于电转中膜和胶之间存在气泡。在转膜过程中要尽量去除气泡,使膜,滤纸和胶紧密结合。同时,抗体孵育的过程中,保持膜的充分浸润。
基础实验

如何测量Western Blot条带灰度值?(GelPro软件使用方法)

2020-8-13 21:31:17

基础实验

激光共聚焦显微镜小结

2020-8-13 21:36:58

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