Western Blot原理及规范操作

Western Blot原理及规范操作

一、Western Blot原理

(本实验以转移到PVDF膜,辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法为例)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中,不连续系统的凝胶包括浓缩胶(spacergel)和分离胶(separation gel),蛋白质在浓缩胶中运动到两层凝胶的交界处时,由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带,即不连续系统的浓缩效应。

在凝胶中,分子量小的蛋白质泳动速度快,分子量大的蛋白质泳动速度慢,即聚丙烯酰胺凝胶的分子筛效应。阴离子去污剂SDS使蛋白质变性,消除不同蛋白分子间的电荷差异和结构差异,使得蛋白质在电场中的泳动速度仅与蛋白质颗粒大小有关。各种蛋白质在不连续SDS-PAGE的浓缩效应和分子筛效应的作用下,按照分子量大小以一定顺序排列形成一个个区带。

将待测样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白变性并分离,用电转移方法转移到固相支持体NC膜或PVDF膜上(本实验以PVDF膜为例),滤膜与抗靶蛋白的非标记抗体(一抗)反应,再用二级免疫学试剂进行检测。

检测方法有放射性标记、酶标化学显色或酶标化学发光等,酶标化学发光法以其高敏感性、结果可在X光片上长期保存等优点而优于酶标化学显色法,本实验以辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法为例。

二、Western Blot规范操作

(一)蛋白制备

1.      取小鼠脑组织 50 mg

2.      匀浆及裂解:PBS漂洗后转移至玻璃匀浆器中球状部位,加 400 µl  RIPA裂解液裂(使用前加入 4 µl PMSF),于匀浆器中进行组织匀浆,然后置于冰上裂解 30 min

3.      离心:用移液器将裂解液移至 1.5 ml 离心管中,然后12000 rpm 离心 5 min,取上清于 1.5 ml 离心管,上清即含有组织蛋白。

4.       20 µl蛋白样品,加入 5 µl 5 x 蛋白上样buffer,沸水浴加热 5 min

(二)垂直电泳

1.      器材清洗:注意一定要将玻璃板洗净,最后用DDW冲洗,将玻璃板置于架子上,放进37℃ 烘箱烘干。

2.      制备凝胶:分别配分离胶、浓缩胶(先别加TEMED)。先用无水乙醇检漏,确定没有渗漏后倒入分离胶(加入TEMED后),用1~2 ml无水乙醇压线,凝固40 min。倒掉无水乙醇,晾干后加入浓缩胶,插入梳子,凝固40 min

(根据目的蛋白的大小来选择合适浓度的分离胶,目的蛋白小于20 kDa选择12%-15% 的分离胶、大于20 kDa选择10% 的分离胶,浓缩胶一般固定为5%

3.      加样:待凝胶制备好后,取出凝胶放入电泳槽中,加入电泳液,每个槽500 ml(提前稀释10倍,50 ml + 450 ml dH2O)。用加样器缓慢加入相同体积的上样蛋白液,样品每孔10 µl(样品每孔总20 µg蛋白,测量浓度后定上样量),Marker每孔1~3 µl2.5 µl)(1 mm 厚玻板的最大上样量为 30 µl/孔),加样过程中一定要避免气泡,同时要在样品旁加预染的蛋白分子量标准,没有样品的孔添加相同体积的 1×RIPA 裂解液和loading buffer 混合液。

 

4.      电泳:加好样品后,80 V电泳30 min,然后 120 V 电泳约 60 min 至溴酚蓝至玻板底部。

             

 

(三)湿转转膜

1.准备试剂与材料:配制转膜液(一个槽800ml,其中Transfer buffer 80 ml,甲醇160 mldH2O 560 ml,转膜液4℃ 预冷)。根据胶块的大小,裁剪PVDF膜和转印滤纸(滤纸要比膜稍微小一些,以防止短路),每转一张膜需准备6张滤纸和1PVDF膜(切滤纸和膜时一定要戴手套,防止手上的蛋白污染膜)。裁剪完后,将滤纸浸入电转buffer中;将PVDF膜浸泡在甲醛溶液中充分湿润

2.叠放转膜结构:打开夹子,使黑的一面保持水平,在上面垫一张海绵垫,来回擀几遍以擀走里面的气泡(一手擀另一手压住垫子使其不能随便移动)。在垫子上垫三层滤纸(可先将三张滤纸叠在一起),一手固定滤纸一手擀去气泡。取胶时先将玻璃板撬掉,轻轻刮去浓缩胶,小心剥下分离胶盖于滤纸上,使其与滤纸对齐,轻轻擀去气泡。将膜盖于胶上,要盖满整个胶(膜盖下后不可再移动)并除气泡。在膜上盖三层滤纸并除去气泡,最后盖上另一个海绵垫,擀几下就可以合起夹子。整个操作在转移液中进行,要不断擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触,以防发生短路。转移液中含甲醛,操作时要戴手套,实验室要开门以使空气流通。

3.进行电转:将夹子放入转移槽槽中,使夹子的黑面对槽的黑面,夹子的白面对槽的红面。电转移时会产生热量,将转移槽埋于冰水混合物中来降温。以恒定电流300mA转膜约90 min。转膜结束后关闭电源,取出夹子。

 

(四)封闭及杂交

1.      封闭:将膜从夹子中取出,标记正反面(蛋白面剪去左上角),用PBST稍加漂洗后,浸没于封闭液中室温摇床摇荡1h                

PBST50 ml 20 x PBS + 950 mldH2O + 1 ml Tween-20(吸的时候只打一档);封闭液:5%奶粉 + PBST(一块膜40 ml)。(2 g奶粉加40 ml PBST

2.      切膜:将膜切成条带(每条剪左上角标记)用笔标记条带。

3.      结合一抗:将膜从封闭液中取出,滤纸贴角稍吸干,置于提前稀释好的一抗中(每个条带加3ml一抗),于冰箱4℃下孵育过夜。

4.       洗涤:回收一抗,用PBST漂洗膜后再浸洗四次,每次7min

5.       结合二抗与洗涤:步骤与一抗的结合与洗涤一致,在提前稀释的二抗中室温轻摇1h,用PBST漂洗膜后再浸洗四次,每次7min(二抗130005%奶粉)

 

(五)HRP-ECL发光鉴定

1. 滴加发光液:将膜从PBST中取出,正面朝上置于塑料膜上。提前按1:1稀释混合A、B发光液,熄灯后,将发光液均匀滴加至PVDF膜上,每条PVDF膜滴加约200 µl,确保无气泡产生。盖上另一张塑料膜,用纸巾擦掉塑料膜外多余的发光液。

2. 显影:至可见绿色荧光条带后,迅速盖上胶片(6片,剪去左上角),关闭胶盒,根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中震荡40次(不可在显影液中浸泡过久,否则整张胶片变黑),迅速清水漂洗40次后放在定影液中至底片完全定影透明(约震荡40次),清水冲净晾干。

3. 标定Marker,EPSON Scan进行图像扫描与分析。

三、注意事项及常见错误操作

1. 凝胶要均一没有气泡;

2.  浓缩胶与分离胶界面要水平;

3.  拔梳子时要快,尽量保证点样孔平整;

4.  滤纸要比膜小一些,以防止短路;

5.  拿滤纸和膜时要戴手套,防止蛋白污染;

6.  PVDF膜一旦活化后就绝对不能让其变干,否则会严重影响实验效果;

7.  转膜时叠放次序不错,同时要防止产生气泡;

8.  加一抗二抗要严格保证反应时间,洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净,有利于降低背景;

9.  在显色发光时要注意发光时间和显影时间的控制,以看得清楚目的条带为标准。

 

四、结果分析及其应用

Western Blot(免疫印迹法)是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术,具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点,是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用方法,主要在分子生物学、生物化学、免疫遗传学等学科中时常用到。WesternBlot是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色,并且通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况。

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