实验技术介绍:免疫组织化学

 “ 免疫组织化学技术是我们实验中常用的组织实验技术,可以观察切片中抗原的数量及其在组织中的分布情况,对抗原进行定位、定性及定量的研究。通过抗原与抗体特异性结合,使标记抗体的显色剂(酶、荧光素、同位素、金属离子等等)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)。

 

最近小编会陆续更新几期实验技术方面的基本介绍,和实验步骤,方便大家遗忘时查阅。这部分内容基本可以囊括大家平时使用的所有基础医学研究技术,大家一定要及时订阅关注哦

      本期介绍免疫组织化学技术。相信大家对该技术已经很熟悉了吧,不妨来一起复习一下吧

一、仪器设备

1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉。
2. 水浴锅。

二、试剂

 

1. PBS缓冲液(ph:7.2―7.4)。
2. 0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液。
3. 0.5mol/LEDTA缓冲液(ph:8.0)。
4. 1mol/L的TBS缓冲液(ph:8.0)。
5. H2O2溶液。
7. 封片剂。
 
三、实验步骤

1、脱蜡和水化:脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
  a. 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟
  b. 无水乙醇中浸泡五分钟
  c. 95%乙醇中浸泡五分钟
  d. 75%乙醇中浸泡五分钟
2、抗原修复:用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片:
   微波炉加热:在微波炉里加热枸橼酸钠缓冲液至沸腾后将组织切片放入,至抗原修复液自然降至室温。
3、免疫组化染色SP法
1) 脱蜡、水化;
2)PBS洗2-3次各5分钟;
3)3%H2O2滴加在玻片上,室温静置10分钟;
4)PBS洗2-3次各5分钟;
5)抗原修复;
6)PBS洗2-3次各5分钟;
7)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟,甩去多余液体;
8)滴加一抗,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时;
9)4℃过夜后需在37℃复温45分钟;
10)PBS洗3次每次2分钟;
11)滴加二抗,室温静置或37℃1小时(二抗中可加入0.05%的 tween-20);
12)PBS洗3次各5分钟;
13)DAB显色5-10分钟,在显微镜下掌握染色程度;
14)PBS或自来水冲洗10分钟;
15)苏木精复染2分钟,盐酸酒精分化;
16)自来水冲洗10-15分钟;
17)脱水、透明、封片、镜检。
4、免疫组化SABC法
1) 脱蜡、水化;
2)PBS洗2次各5分钟;
3)用蒸馏水或PBS配制新鲜的3%H2O2,室温封闭5-10分钟,用蒸馏水洗3次;
4)抗原修复;
5) PBS洗5分钟;
6)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟,甩去多余液体;
7)滴加一抗,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时;
8)PBS洗3次各2分钟;
9)滴加生物素化二抗,20℃-37℃ 20分钟;
10)PBS洗3次各2分钟;
11)滴加试剂SABC 20℃-30℃ 20分钟;
12) PBS洗4次各5分钟;
13) DAB显色:试剂盒或自配显色剂显色;
14)脱水、透明、封片、镜检。

四、免疫组化常见问题
1、染色过强
  a. 抗体浓度过高或孵育时间过长 降低抗体滴度、抗体孵育时间:室温1小时或4度过夜;
  b. 孵育温度过高超过37度 一般在室温20-28度;
  c. DAB显色时间过长或浓度过高 显色时间不超过5-12分钟,以显微镜下观察为准。
2、非特异性背景染色
  a. 操作过程中冲洗不充分 每步冲洗3次每次5分钟;
  b. 组织中含过氧化物酶未阻断 可再配置新鲜3%H2O2封闭孵育时间延长;
  c. 组织中含内原性生物素 正常非免疫动物血清再封闭;
  d. 血清蛋白封闭不充分 延长血清蛋白封闭时间。
3、染色弱
  a. 抗体浓度过低、孵育时间过短 提高抗体浓度、孵育时间不能少 于60分钟;
  b. 试剂超过有效使用时间 应更换试剂;
  c. 操作中添加试剂时缓冲液未沥干 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液使试剂稀释 (应防止切片干燥);
  d. 室温太低 低于15度 要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟或4 度冰箱过夜;
  e. 蛋白封闭过度 封闭不要超过12分钟。
4、染色阴性
  a. 操作步骤错误 应重试 设阳性对照;
  b. 组织中无抗原 设阳性对照以验证试验结果;
  c. 一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗二抗种属无误。
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