脂肪组织能量消耗过程中动态转录组的变化揭示LncRNA的关键作用

 “ 长链非编码RNA(LncRNA)一般指不具有蛋白编码能力,转录本长度超过200nt的RNA分子。LncRNA与细胞周期和分化、发育、生殖、性别调控、衰老以及多种人类疾病密切相关。LncRNA数量比较多,大约是为mRNA的3-100倍,但是目前多数LncRNA的功能仍不清楚,有很大的研究空间。因此,LncRNA是目前生物和医学研究中的热点话题之一。
本期我们选择了一篇LncRNA的研究文章。该文章主要是研究脂肪组织变过程中LncRNA发挥作用的分子机制。该文章发表于PLOS Biology,IF=8.386。
       人体内有2种脂肪,白色脂肪组织(WAT),主要负责储存脂肪;棕色脂肪组织(BAT),主要负责燃烧脂肪WAT可以被诱导出现BAT特性,行使类BAT功能,这一过程被称为褐变。所以促进WAT褐变是目前一个很具有吸引力的治疗肥胖的新靶点。

结论一:多种条件下诱导褐变

       作者首先利用三种方法诱导WAT褐变,包括寒冷,CL316243刺激,游泳运动(Figure 1A)。3种条件下动物的食物摄取量均增加,寒冷和运动条件下动物的体重显著降低。附睾WAT(eWAT)质量在3种条件下均显著降低,而腹股沟WAT(iWAT)只在寒冷和运动条件下降低。
       mRNA聚类分析结果表明,每种条件下的样品紧密聚集,而基于LncRNA表达的聚类结果完全反映了对mRNAs的观察模式(Figure 1B)。

因此,基于表达谱,LnRNA似

乎是更强大的脂肪状态的分子标记,可以用来表征脂肪组织对不同环境刺激的反应。

Figure 1

结论二:LncRNA参与BAT生物学过程
       在寒冷、CL316243和运动下,mRNA分析如Figure 1D,F。针对29个小鼠不同组织,通过基因集富集分析,上调的机制包括BAT特异性基因集、细胞呼吸和氧化能量衍生,表明类BAT表型的获得;下调的机制包括WAT特异性信基因集和一些免疫-功能相关的生物学过程,暗示褐变过程中WAT特征的丧失以及免疫细胞的重塑。
       相应地LncRNA的分析结果显示如Figure 1E,G。上调和下调的mRNAs以及LncRNAs分别与BAT-enriched基因集、免疫细胞相关基因集显示最强的重叠(Figure 1H,I),这表明受调控的LncRNAs也可以在BAT相关的生理过程和免疫细胞重塑中起作用。
通过ChIP-seq数据发现在每种褐变条件下,对于mRNAs和LncRNAs,转录因子结合位点与上调基因启动子高度显著重叠,且在
寒冷条件下最强(Figure 1J),暗示PparY和Prdm16可能在mRNAs和LncRNAs表达过程中起着调节作用。

  

  

结论三:BAT激活和失活过程中的转录组调控

       接下来检测BAT活化和热中性失活过程中差异转录本变化(Figure 2A)。GSEA富集分析结果显示BAT活化过程中WAT特异性基因集表达的增加以及BAT特异性基因集表达的缺失。

      基于5种不同条件(3种褐变条件、以及BAT活化和BAT失活条件)下的转录组变化表征,研究者试图确定多种条件下显著受调节的基因,尤其是在褐变和BAT活化中上调并在BAT白化中下调的基因。发现了60个mRNAs出现显著变化,包括Ucp1, Dio2, Fabp3等脂肪酸代谢过程中的关键基因。在相同的条件下筛选确定了6个LncRNAs,包括LncBATE10(Figure 2D,E)。

Figure 2

结论四:LncRNA的功能推断

       LncRNA的PCA分析结果与mRNA的PCA分析结果一致(Figure 2G),表明mRNAs和LncRNAs之间存在内在功能连接。
为了系统地预测LncRNA功能,选择在5种检测条件下至少在3种中受调节的mRNAs和LncRNAs,共得到了819个mRNAs和79个LncRNAs。基因共表达网络聚类进一步揭示了主要的3个簇(Figure 2H),对于每一个簇,将基因分组成四个功能大类,包括代谢过程、免疫过程、细胞过程等。其中,氧化磷酸化和呼吸电子传递在簇1和2中显著富集,免疫功能相关的过程在簇3中显著富集。
之前的研究证明,在棕色脂肪细胞和白色脂肪细胞中,LncBATE1对于完整的BAT程序表达是必需的。在构建的mRNA-LncRNA网络中,LncBATE1与Cebpβ、Dio2、Ucp1、Fabp3、Elvol3和其他脂质代谢基因相关联,证明了构建方法的有效性。
值得注意的是,LncBATE1还与另一个LncRNA-LncBATE10存在关联,两者都与Ucp1、Dio2、Dgat1等其他脂质分解代谢相关基因共表达,暗示LncBATE10在BAT相关过程中的功能调控作用。

结论五:LncBATE10在BAT中高度富集

       与eWAT、iWAT和其他大部分组织相比,LncBATE10在BAT中高度富集(Figure 3A,B)。通过体外分离原代棕色和白色前脂肪细胞,检测LncBATE10在体内分化过程中的时间表达情况发现,LncBATE10在棕色脂肪细胞分化过程中上调倍数大于100倍(Figure 3C)。

       为了确定LncBATE10表达是否与BAT活性相关,通过寒冷刺激小鼠激活BAT,热中性使BAT失活。结果显示,相较于对照,LncBATE10在BAT活化中表达量上调约7倍,在BAT失活中表达量被抑制约60%。(Figure 3D,E)。这些结果显示LncBATE10可能在BAT和iWAT褐变中起调控作用。

Figure 3

      为了确定LncBATE10的生物学功能,在原代棕色前脂肪细胞中敲降LncBATE10的表达,qPCR分析显示泛生脂标记物,Cebpa, PparU和Fabp4,出现轻微下调。利用LncBATE10敲降和对照细胞的RNA-seq,在全基因组水平确定LncBATE10缺失造成的影响。GSEA分析结果显示,下调最显著的信号通路与呼吸电子传递相关,这是BAT功能的标志之一。
检测WAT和肌细胞分子标记物的基因表达发现,LncBATE10敲低没有引起明显的变化。利用去甲肾上腺素处理分化的棕色脂肪细胞,进一步检测LncBATE10对棕色脂肪细胞活化的影响。结果显示,NE处理显著刺激产热基因Ucp1和Pgc1α的表达,但敲低LncBATE10后诱导效应被减弱。因此,LncBATE10对于BAT特异性基因的完全诱导是必不可少的。
原代棕色前脂肪细胞过表达LncBATE10,发现没有引起脂质积累和BAT分子标记表达的显著变化,表明LncBATE10需要辅助因子才能行使功能。

结论六:LncBATE10是诱导体内WAT褐变所必需

       在白色脂肪细胞中敲降LncBATE10的表达,通过RNA-seq和GSEA分析,进一步检测敲降LncBATE10后引起的全基因组效应,结果显示,与呼吸电子传递相关的信号通路显著下调。

       有趣的是,白色脂肪和棕色脂肪中大部分信号通路是相同的,表明LncBATE10在两种细胞类型中具有相似的作用。为了确定LncBATE10在WAT褐变中的功能,在WAT细胞敲低LncBATE10,并用NE或NE联合罗格列酮处理细胞。

      结果显示,药物治疗可显著诱导BAT分子标记的表达,如Cidea和Ucp1,但敲低LncBATE10会使这些基因表达减弱。为了检测LncBATE10是否促进WAT褐变,在iWAT脂肪细胞和3T3-L1细胞中过表达LncBATE10,并没有观察到标记表达的差异变化,表明LncBATE10是BAT选择性表达程序所必需的,但并不充分。

       为了检测LncBATE10在体内WAT褐变中的功能,在小鼠iWAT每侧注射LncBATE10腺病毒,48小时后将小鼠进行寒冷处理诱导褐变,检测组织中BAT特异性标记。结果显示,约80%的LncBATE10被敲除,并伴随着BAT特异性标记的显著下调,包括Ucp1、Dio2和 Pgc1α,但不包括泛生脂肪标记物PparY。因此,LncBATE10诱导对于体内WAT褐变是必需的。

结论七:LncBATE10受到cAMP-Creb信号通路的调控

       如Figure 4D所示,通过寒冷处理,LncBATE10与肾上腺素能使受体-cAMP信号通路出现显著变化。利用NE和cAMP分别处理棕色脂肪细胞,在两种条件下均检测到LncBATE10的快速诱导(Figure 4A),证明了cAMP通路在LncBATE10表达中的调控作用。
      cAMP是可以通过磷酸化调控下游基因,如Ucp1和Pgc1α,并激活转录因子Creb(cAMP应答元件结合蛋白)的表达,推测Creb可以调控LncBATE10的转录。
       MatInspector序列分析发现了LncBATE10启动子区域存在一些Creb结合位点,荧光素酶报告实验结果显示,启动子2.6kb区域存在响应cAMP信号的调控元件。
       棕色脂肪细胞ChIP-PCR结果显示,Forskolin(激活cAMP表达)处理后,Creb与鉴定的结合位点之间的结合显著上调(Figure 4)。总之,这些结果表明LncBATE10受到cAMP-Creb信号通路的调控。

Figure 4

结论八:LncBATE10与Pgc1α mRNA竞争性结合Celf1

     
       为了理解LncBATE10行使功能的具体机制,研究者在体外转录加生物素标记的LncBATE10,并对LncBATE10相互作用的蛋白质pull down后进行质谱分析。结果显示,RNA结合蛋白(RBPs)高度富集,并与RNA过程密切相关。其中,鉴定了34个含有多于10个特异肽段的蛋白质,以及相较于对照高度富集的3个RBPs,HuR、Celf1和Celf2。
针对HuR、Celf1和Celf2进行RIP-PCR,检测LncBATE10的表达水平,结果显示,Celf2的IP表现出非常强的富集信号(Figure 5A),因此选择Celf2进行进一步的研究。

Figure 5
      Celf1可以通过结合其靶基因mRNA的3’UTR,促进RNA降解和抑制翻译。故作者猜测LncBATE10捕获Celf1,否则Celf1可能抑制BAT分化和激活重要因子的表达。
      Celf1-RIP实验结果显示,敲降LncBATE10后Pgc1α被显著富集(Figure 5B,C),表明LncBATE10通过靶定Celf1保护Pgc1αmRNA。但是敲降LncBATE10的细胞中没有检测到Celf1蛋白的显著变化。
       检测LncBATE10和Pgc1α的RNA的序列,来寻找Celf1蛋白结合位点(CBS),以前的研究表明可能富含UCU区域。在本研究有两个类似的片段被鉴定出来(Figure 5D),为了检测这些区域是否可以结合Celf1,作者扩增并在体外转录这两个片段,进行RNApull-down分析,结果显示,这两个片段可以充分拉下Celf1,表明拥有Celf1结合位点(Figure 5E)。
结论九:Celf1可以抑制Pgc1α的mRNA活性
     作者尝试确定Celf1是否能抑制Pgc1αmRNA的表达还不确定。在原代棕色前脂肪细胞中过表达Celf1,分化后,发现Pgc1α被显著抑制。并且在Celf1过表达时脂肪生成也被抑制,暗示降低的Pgc1α水平可能受脂肪形成的间接影响。
      为了检测Celf1抑制Pgc1α的mRNA表达的结合位点,作者使用荧光素酶报告发现,含有Celf1结合位点会导致荧光素酶活性显著降低,其可以通过敲低内源性Celf1显著被抑制(Figure 5 K,M,N)。因此,确定了Celf1通过作用于结合位点抑制Pgc1αmRNA的活性。
      
原文:Dynamic transcriptome changes during adipose tissue energy expenditure reveal critical roles for long noncoding RNA regulators.
杂志:PLOS Biology,IF=8.836.
Pubmed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28763438/?from_term=dynamic+transcriptome+changes+during&from_filter=ds1.y_5&from_pos=1.
DOI:10.1371/journal.pbio.2002176.
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