miR‐15b‐5p通过靶向sema3A抑制细胞凋亡、氧化应激和炎症反应,改善了高糖诱导的足细胞损伤

miR‐15b‐5p通过靶向sema3A抑制细胞凋亡、氧化应激和炎症反应,改善了高糖诱导的足细胞损伤
前情提要
糖尿病肾病(DN)是糖尿病的一种严重的并发症。足细胞损伤是糖尿病肾病(DN)的一个标志。在DN的多种病理机制中,凋亡、氧化应激和炎症在DN的发生发展中起重要作用氧化应激是由超过细胞抗氧化能力的ROS产生引起的,可诱导蛋白修饰和脂质过氧化。DN的特点是促氧化和抗氧化之间的不平衡,并伴有ROS产生的增加ROS被认为是DN损伤的常见机制。糖尿病期间,ROS在肾脏的积累会破坏氧化还原平衡,进一步增加肾组织的氧化应激,从而导致肾脏损伤。高糖诱导的氧化应激可激活参与DN发展和进展的主要途径。ROS可以激活多种细胞反应,这些反应在高糖诱导的肾损伤中发挥重要作用。MDA是氧化应激的常用指标。超氧化物歧化酶(SOD)是催化超氧自由基抑制氧化的关键抗氧化酶。NOX4被认为是DN中增加氧化应激的主要酶。炎症DN中起着重要作用。在不受控制的糖尿病期间,各种类型的炎症介质产生过量。足细胞凋亡DN的早期病理表现。氧化应激炎症DN的发展过程中发挥了基本作用,从而诱导细胞凋亡。高血糖激活的氧化应激是DN的重要组成部分。高血糖可促进氧化应激和细胞凋亡,加重足细胞损伤。糖尿病高水平的炎性细胞因子有助于进一步驱动氧化应激,使肾脏损伤更加明显,从而形成恶性循环高糖状态引发氧化应激和炎症反应,这两种途径的相互作用进一步复杂化了高糖诱导的损伤。因此,抑制氧化应激可以防止高糖诱导的肾损伤
microRNAs (miRNAs)是单股小的非编码RNA(21‐25个核苷酸)。它们与蛋白质编码基因的mRNA结合并抑制其翻译。证据表明,miRNAs参与了DN的发病机制。最近的一项研究表明,miR‐15b‐5p在链脲霉素诱导的糖尿病大鼠的视网膜内皮细胞中表达增加。在高条件下培养的视网膜内皮细胞miR‐15b‐5p降低,提示miR‐15b‐5p是治疗糖尿病视网膜病变的潜在治疗靶点。然而,miR‐15b‐5pDN中的作用尚未阐明。
semaphorin 3A (sema 3A)是一种分泌蛋白,属于足突细胞轴突定向因子家族。sema3aDN潜在的治疗靶点。诱导糖尿病后,sema3A在足细胞和远端小管中高表达。此外,sema3A失活可抑制缺血/再灌注引起的肾脏炎症,并抑制小管上皮细胞(TECs)凋亡。此外,sema3A的沉默可减弱脂多糖诱导的炎症和TECs的凋亡。
目的
本研究旨在探讨miR‐15b‐5p高糖触发足细胞损伤中的潜在作用,以阐明其潜在机制并确定DN的潜在治疗靶点。
方法
细胞培养和处理细胞转染逆转录聚合酶链反应、蛋白印迹、MTT评估、细胞凋亡检测抗氧化剂的检测、细胞内活性氧的测定酶联免疫吸附测定生物信息学分析双荧光素酶报告基因试验
结果与讨论
研究中,观察到高糖的直接刺激导致细胞增殖显著下降,而miR‐15b‐5p过表达挽救了这一现象。然而,miR‐15b‐5p的引入显著地阻止了高糖触发的细胞凋亡,表明miR‐15b‐5p保护足突细胞免受高糖介导的细胞凋亡的影响。基于上述研究结果,miR‐15b‐5p可以有效保护足突细胞,其表现为细胞增殖增加和凋亡抑制。
研究中,高糖刺激明显加剧了ROS的生成,而miR‐15b‐5p的引入减少了ROS的生成,这表明miR‐15b‐5p具有抗氧化特性。同时,检测了氧化应激相关的指标。与预期一致的是,MDA含量增加,SODCAT的活性显著下降,表明机体对高糖有氧化应激反应。然而,miR‐15b‐5p的增加强烈地逆转了这些改变。此外,高糖暴露增加了NOX4mRNA和蛋白水平的表达,而这些影响被miR‐15b‐5p过表达所消除。miR‐15b‐5p明显减轻了高糖介导的氧化应激,增强了抗氧化能力,证明miR‐15b‐5p高糖刺激的足突细胞的氧化应激具有保护作用。
研究中,我们报道了高糖明显提高IL‐1β, TNF‐α, and IL‐6细胞因子的表达,而miR‐15b‐5p的增加则降低了这些细胞因子的分泌,这意味着miR‐15b‐5p通过减少高糖诱导的足细胞炎症介质的产生而具有抗炎作用。最重要的是,这些发现暗示miR‐15b‐5p在保护足突细胞免受高糖诱导的损伤方面发挥了抗炎作用。
在研究中数据显示,sema3A表达在对高糖的响应中显著上升。根据生物信息学分析,预测miR‐15b‐5p直接针对sema3A。然后,通过双荧光素酶报告基因检测,miR‐15b‐5psema3A之间的结合相关性得到确认,该结果表明miR‐15b‐5p的增强显著降低了sema3A3′‐UTR的荧光素酶活性。更重要的是,miR‐15b‐5p负调控了sema3AmRNA和蛋白表达水平。因此,我们试图探究sema3A是否参与miR‐15b‐5p高糖触发的足突细胞损伤的保护作用。正如预期的那样,sema3A严重抵消了miR‐15b‐5p高糖诱导的细胞凋亡、氧化应激和炎症过程的有利影响,这表明在miR‐15b‐5p高糖刺激的足细胞的有利影响中,sema3A是必不可少的。
总结
我们提供了第一个证据,miR‐15b‐5p通过缓解细胞凋亡和氧化应激,并通过针对sema3A抑制炎症反应,改善了高糖条件下足细胞损伤。
研究思路
研究建立高糖诱导足细胞损伤模型,模拟体外DN。作为评估miR‐15b‐5p在暴露于高糖的足细胞中的功能的第一步,通过RT – PCR检测在高糖处理后指定时间段(0244872 hr) miR‐15b‐5p的表达。为探讨miR-15b-5p在足细胞损伤中的功能作用,将miR-15b-5p转染足细胞。RT-PCR检测证实转染效率。首先评估暴露于高糖时miR‐15b‐5p影响的足细胞的增殖能力。随后采用ELISA法分析了高糖诱导的细胞凋亡。为了探索miR‐15b‐5p高糖触发的细胞凋亡的作用机制,检测了凋亡标志物Bcl‐2BaxC‐caspase‐3的表达。为了确定miR‐15b‐5p高糖诱导的氧化应激的影响,使用DCF‐DA分析了ROS的生成。测定了MDA含量及抗氧化酶SODCAT的活性。为了阐明miR‐15b‐5p高糖诱导炎症中的作用,评估了miR‐15b‐5p促炎细胞因子IL‐1β, TNF‐α, and IL‐6产生的影响,这些细胞因子已知在高糖诱导炎症中起作用。采用ELISA法进一步测定这些炎性细胞因子的浓度,以证实上述结果
为了更好地理解miR‐15b‐5p高糖诱导足细胞损伤中的分子机制,我们使用靶标预测程序(包括TargetScanmiRandaPicTar)的生物信息学分析来预测miR‐15b‐5p的假设靶标。我们构建了一个双荧光素酶报告系统来验证计算预测我们进一步确定miR‐15b‐5p是否调节了接触高糖的足突细胞中sema3A的表达通过对sema3A蛋白进行western blot验证。为了阐明sema3A是否有助于miR‐15b‐5p高糖诱导的足突细胞损伤的有益影响,进一步的实验。

References:

Fu, Y., et al., miR15b5p ameliorated high glucoseinduced podocyte injury through repressing apoptosis, oxidative stress, and inflammatory responses by targeting Sema3A. Journal of Cellular Physiology, 2019. 234(11): p. 20869-20878.

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