梓醇对高糖诱导足细胞损伤的保护作用及其机制

梓醇对高糖诱导足细胞损伤的保护作用及其机制

 
前情提要
糖尿病是一种常见的内分泌疾病,会导致许多危险的并发症,包括糖尿病肾病(DN)DN是世界范围内终末期肾病(ESRD)的主要病因之一,其特点是以微量白蛋白尿为最早的临床表现。DN早期主要是一种肾小球疾病,足细胞丢失多见于DN患者,DN中足细胞丢失与蛋白尿存在相关性。
足细胞是高度特化的终末分化的内脏上皮细胞,覆盖在肾小球基底膜表面,构成肾小球滤过屏障,在维持肾小球选择性滤过中发挥关键作用。越来越多的证据表明足细胞损伤是DN的主要危险因素之一,减轻足细胞损伤可以改善DN。但目前缺乏有效的治疗药物来减轻足细胞损伤。
高糖处理显著降低了细胞存活率,增加了凋亡细胞的百分比足细胞暴露于高糖会导致炎症
梓醇一种天然环烯醚萜苷,是从长期用于中药的地黄中提取的主要活性成分。据报道,梓醇具有广泛的药理活性,包括抗DN。先前的一些研究表明梓醇可以改善肾功能,减少蛋白尿,这与DN的足细胞损伤密切相关。然而,梓醇是否对DN的足细胞损伤有保护作用仍不清楚。梓醇的抗凋亡作用已经在几个模型中得到证实。梓醇可通过抑制人单核细胞THP-1细胞的NADPH氧化酶活性来抑制AGE诱导的细胞内ROS的产生
NOX4一种与糖尿病相关的关键酶,已知在各种条件下会增加足细胞中的ROS水平依赖NOX4的ROS产生诱导足细胞凋亡,这在DN条件下的足细胞损伤中观察到。
活性氧(ROS)是正常代谢和异物暴露的产物,是DN发病的主要因素,对足细胞凋亡的启动起着至关重要的作用。已经证实在DN的足细胞中ROS过度产生。
细胞凋亡是细胞死亡的一个严格控制的过程,是生物体发育和典型细胞生长所必需的,在体内和体外DN模型中都观察到足细胞凋亡Bax和Bcl-2是固有凋亡反应的关键介质,Bax刺激细胞凋亡,Bcl-2抑制细胞凋亡通常用Bcl-2/Bax的比值来评价细胞凋亡的程度,当该比值降低时,表明细胞凋亡受到刺激
ROS调控p38MAPK/NF-κB信号通路在细胞凋亡炎症中起重要作用。ROS下游的促凋亡信号因子p38MAPK的激活导致细胞凋亡。过量的ROS可以激活促凋亡的p38MAPK信号通路,这与DN的足细胞损伤和蛋白尿有关。NFκB是参与DN进展的重要转录因子,也是p38MAPK活化的重要下游转录因子
TLR4/MyD88信号通路在体内和体外DN模型足细胞损伤的炎症反应中起重要作用,TLR4基因敲除被证明可以减轻高糖诱导的足细胞损伤中细胞凋亡的增加。TLR4可以招募MyD88,在足细胞损伤中还可以激活NF-κB信号通路和细胞因子的产生。
目的
本研究采用高糖诱导的足细胞损伤模型,探讨梓醇对高糖诱导的足细胞损伤的保护作用及其机制。
方法
细胞培养
MTT  检测细胞活力
乳酸脱氢酶评估  检测细胞活力
流式细胞仪检测
二氯荧光素法  检测ROS氧化应激
Annexin V/PI染色  检测凋亡
SOD和MDA  测定氧化应激
ELISA  检测足细胞炎症细胞因子水平
免疫荧光染色  检测凋亡
免疫印迹  检测蛋白表达  
结果及讨论
梓醇能逆转高糖诱导的足细胞损伤。研究中,高糖降低足细胞Bcl-2/Bax的比值,导致足细胞凋亡,梓醇升高足细胞Bcl-2/Bax的比值,表明梓醇对凋亡有很大的阻断作用。高糖可促进促炎细胞因子IL-1β、T N F-α和IL-6的分泌,梓醇可逆转这一作用。研究中,高糖增加了NOX4的表达和细胞内ROS水平梓醇可缓解NOX4和ROS的升高。这些结果为梓醇拮抗高糖诱导的ROS生成提供了证据,表明梓醇对高糖诱导的足细胞损伤的抗凋亡和抗炎作用与其抗氧化作用有关。
研究中,虽然对照组高糖处理的足细胞中p38MAPK的表达没有差异,但高糖处理的足细胞中p38MAPK的磷酸化明显高于对照组处理的足细胞,这种磷酸化被梓醇逆转。研究中,高糖处理的足细胞的p-I Bα和NF-κB的核转位明显高于对照组处理的足细胞,而梓醇可抑制这两种作用。这些结果表明梓醇可以抑制高糖诱导的足细胞损伤中的p38MAPK/NF-κB信号通路,这与梓醇的抗凋亡和抗炎作用有关。
研究中,TLR4/MyD88信号通路被激活,在高糖诱导的足细胞损伤中观察到细胞因子的产生,这与一些研究的结果一致。梓醇可显著下调TLR4和MYD88的表达,从而阻止I-κBα磷酸化和降解,可能抑制NF-κB移位到细胞核内,从而抑制炎症反应的激活。
总结
本研究证实梓醇对高糖诱导的足细胞损伤具有抗凋亡和抗炎作用。这些作用可能与抑制NOX4,减轻活性氧生成,抑制TLR4/MyD88和p38MAPK信号通路,阻止NF-κB活化和移位有关。因此梓醇有望成为治疗糖尿病肾病足细胞损伤的有效药物。
研究思路 
MTT试验LDH释放实验发现细胞活力显著提,即梓醇糖诱导的足细胞有保护作用。在为确定梓醇对高糖条件下足细胞抗氧化酶活性的影响,我们测定了SOD活性和MDA水平。此外,我们接下来评估了用DCFH-DA染色的足细胞中ROS的产生发现梓醇可抑制高糖诱导的足细胞ROS生成为了评估高糖ROS生成酶表达的可能影响,我们分析了已知在不同条件下增加足细胞ROS水平的与糖尿病相关的关键酶NOX4的表达为了阐明梓醇的保护作用是否与减少凋亡有关,采用流式细胞仪检测足细胞凋亡。诱导的足细胞损伤总是与炎症相关。为探讨梓醇的抗炎作用,我们用ELISA法检测了处理组大鼠足细胞IL-1β、IL-6和TNF-α的水平TLR4/MyD88信号通路在足细胞损伤中起重要作用。由于ROS可以通过p38MAPK/NF-κB信号通路诱导细胞凋亡,我们分析了p38MAPK和IκBα的表达及其磷酸化。此外,该研究还做了免疫荧光染色研究发现显著增加NFκB向细胞核的易位梓醇逆转了这一作用

References:

Chen, Y., et al., The protective effect and mechanism of catalpol on high glucose-induced podocyte injury. BMC Complementary and Alternative Medicine, 2019. 19(1).

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