qPCR引物怎么设计

今天很想介绍一下qPCR引物怎么设计,奈何家里就是打不开NCBI软件。好像最近是一直很难打开它。中美关系搞得,网站都不让上了。设计引物很简单,自己设计好,找公司合成十几块钱;如果找公司设计,那贵了去了,为了节约经费,买更重要的试剂,当然是自己设计了。

首先,打开NCBI,在gene下,输入你要设计得基因,搜索。我举个IL得例子。

搜索出来很多,选择你要的物种,一个基因有很多名字,在aliases里,留意别名。

然后点击基因再进去,一直往下拉,出现一个mRNA and protein,下面NM就是mRNA,NP就是蛋白。有的基因表达多个剪切体蛋白,会有好几条,设计mRNA引物,随便点一个NM进去。

然后出来基因名字,下面有个FASTA,点进去就是基因序列,复制序列。

然后打开另一个网站,网址是下面

进去是这样的,

paste sequence,下面有个框,把FASTA序列,复制进去。下拉,下面填写条件。

按上面的条件,填好,又上角pick primer,点击,就出来了。

出来很多条,自己要选择一下,条件主要有2个,
1.两端前5个序列,G和C含量≤3个,这样解链温度低;
2.两条引物不要位于同一个外显子区域。
如何查看外显子区域呢,下面图里这个页面往下拉有的,我的网实在打不开了。相信你会找到的。

最后,最好是BLAST一下,就是验证一下,你的引物,只扩增你要的基因。NCBI或者Pubmed,主页下面有BLAST。

点击进去,

选nucleotide BLAST,进去

把序列复制到框里,点击最下面BLAST,就好了。家里的网太差了。打开网页用了好久好久。

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