CRISPR/CA技术的原理与同源重组修复

CRISPR/CAS是近年来迅速崛起的第三代基因编辑技术,目前已被广泛应用于定点剪切靶基因的相关实验中,而被精准剪切的基因又可利用同源重组修复进行一系列的基因编辑(插入荧光蛋白等)。本期的i科研,小编将向大家简单介绍CRISPR/CAS及同源重组修复技术的原理。

CRISPR/CAS是细菌用来防御噬菌体DNA注入和质粒转移的天然防御系统,CRISPR/CAS的全称是Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/ CRISPR-associated protein 9(Cas9)即“规律成簇的间隔短回文重复和CRISPR相关蛋白”。简单来说,CRISPR/CAS是一种细菌的“获得性”免疫系统,当噬菌体首次入侵时,其基因组被切割成片段后会被加入CRISPR系统的“资料库”,当噬菌体再次入侵时,CRISPR系统被再次激活,对噬菌体DNA进行精准切割。

简单来说,CRISPR/CAS系统发挥靶向切割功能分为三个阶段:

间隔序列(spacer)的获取和整合

噬菌体感染细菌时,会将自己的DNA注射进入细菌胞内。此时,细菌会将噬菌体基因序列中的一小段即前间隔序列(Protospacer)剪切下来加入到自己的CRISPR座中。新加序列总是整合到前导序列和第一个重复序列之间,这个过程由Cas1/2来完成。Cas1与Cas蛋白形成二聚体对外源DNA进行切割,并请将其整合到CRISPR座上。需要注意的是Cas1/2只能切割3’端是NGG(NCC)的片段。这个NGG序列被称为前间隔片段临近基序(protospacer adjacent motif, PAM)。不同的CRISPR系统具有不同的PAM,PAM序列对Cas蛋白发挥切割高性能是至关重要的。

 CRISPR序列的转录

当具有相同序列的病毒再次入侵时,CRISPR序列首先转录成CRISPR前体RNA (Pre-crRNA),Pre-crRNA再在Cas酶的作用下,被切割成成熟的CRISPR RNA,即crRNA。此时crRNA只含有单一的间隔序列(spacer)。在II型的CRISPR系统中,该过程由Cas9和III型的RNase来协同完成。

在这切割过程中,有一个关键点需要说明:Cas蛋白与III型RNase想要完成对pre-crRNA进行切割的必要条件是CRISPR系统表达的tracrRNA (trans-activating crRNA)与pre-crRNA进行互补。tracrRNA的序列一般位于Cas基因的上游或Cas基因与CRISPR序列之间。tracrRNA可转录出2条89bp和171bp的RNA。2条tracrRNA约含有25个碱基可与Pre-CRISPR中的重复序列进行碱基互补。Cas蛋白与III型RNase对pre-crRNA进行剪切后产生了成熟的双链tracr-crRNA结构。

 对靶基因的剪切

Cas9蛋白与成熟的tracr-crRNA形成复合物对靶基因进行扫描,与靶基因的前间隔序列结合后对靶基因进行剪切。

在各种内源性因素和外源性因素的共同作用下,细胞内的DNA会发生损伤,其中双链DNA的断裂(Double-strand breaks, DSBs)对细胞来说是一种极为危险的情况,细胞会对这种损伤迅速启动相应的修复机制。

近年来,随着核酸酶介导的靶向基因组编辑技术迅速发展,CR|SPR/Cas9基因编辑系统可以使基因组DNA双链发生断裂,断裂后的DNA再通过不同的修复机制来对靶基因进行编辑。

基因修复的主要途径主要包括非同源末端连接修复(Non-homologous end-joining, NHEJ)和同源重组修复(Homologous recombination, HR)两种,但是还存在有其它的非同源重组修复途径,例如微同源末端连接(MMEJ,Microhomology-mediatedendjoining)和单链退火途径(Single-strand annealing SSA)。其中,同源重组技术是一种重要的DNA损伤修复方式之一,也是目前实验室应用最广泛的技术。

同源重组修复主要发生在细胞周期的S和G2期,是维持基因组完整性确,保遗传信息高保真性的一种DNA修复机制。同源重组修复(homologous recombination repair, HRR)和PARP(poly(ADP-ribose)polymerase)是DNA损伤修复的两种重要机制,其中HRR参与DNA双链损伤修复,PARP负责DNA单链损伤修复。

在实际操作过程中,通常会在细胞中导入具有同源臂的模板基因,即具有与靶基因两侧相同序列的基因。断裂的双链会在模板DNA的引导下,进行DNA合成,填补缺口。一般来说,同源重组修复的活性要低于非同源末端连接(Non-homologous End Joining-NHEJ)

同源臂的设计一般在500bp-2000bp不等,模板DNA既可以是单链DNA也可以是双链DNA。在修复的过程中,靶DNA双链的断裂处会与模板DNA的同源臂结合后从而启动同源修复。

同源重组修复是定点基因的重要工具,可利用该技术进行基因组的单碱基突变、插入绿色/红色荧光蛋白。

基础实验

南北印迹传奇:Southern blot与Northern blot

2020-8-14 23:37:49

基础实验

实时荧光定量(RT-qPCR)原理篇(二)

2020-8-14 23:40:43

加入Q群
0 条回复 A文章作者 M管理员
    暂无讨论,说说你的看法吧
个人中心
今日签到
有新私信 私信列表
搜索