南北印迹传奇:Southern blot与Northern blot

每当和来自天南海北的朋友们聚在一起,南北差异就永远是一个聊不完的话题,语言差异、衣食住行等。随便找点什么都能聊上半天,甚至一碗豆腐脑是甜的还是咸的都能争的面红耳赤,真是又好笑又尴尬。今天我们就来聊一聊生物实验中的南北传奇Southern blotNorthern blot(图1)

1  一张图了解Southern blotNorthern blot

Southern Blot 全流程解析

Southern印迹法(Southern blot),是由英国生物学家Sir Edwin Southern1975年发明,并因此得名。目的是检测经过电泳分离后的样品中含有特定序列的DNA片段。首先,不同大小的分子在经过电泳之后,会分布在胶体上不同的位置。接着,利用虹吸作用这些DNA分子转染到一张薄膜上,经DNA变性使它们的双链分开;然后将薄膜暴露在杂交探针里,让探针和DNA杂交。探针是由可以产生放射线、或可以释放出荧光或特定颜色的物质标记的单股DNARNA片段;最后观察结果。薄膜上可以检测到放射性或者荧光讯号的位置,就是与探针进行结合的DNA序列。

Southern blot基本过程:

1制备DNA样品

将新鲜组织研磨成匀浆收集细胞,或将培养好的细胞用胰酶处理后收集。先反复用酚处理细胞两次后,加入氯仿抽提蛋白质。用乙酸钠和无水乙醇沉淀DNA,并用70%乙醇洗涤一次,加入TE缓冲液溶解。用琼脂糖凝胶电泳确认基因组DNA成功提取后,加入限制性内切酶消化,过夜反应。

2琼脂糖凝胶电泳(或聚丙烯酰胺凝胶)

制备0.8%-1.0%的凝胶,用0.5×TBE作电泳缓冲液,根据胶的长度,在1V/cm的电压下电泳,等上样缓冲液(如溴酚蓝等)到达特定位置停止。

3 DNA变性

1 DNA受酸、碱、热等处理均能发生变性,但强酸会使核酸降解。一般认为碱变性较好,可避免DNA降解。

将凝胶在脱嘌呤液中浸泡20 min(若靶序列大于5kb则需要此步骤),室温轻轻晃动至溴酚蓝从蓝变黄。漂洗一次后在变性液(0.5 mol/L NaOH1.5 mol/L NaCl)中浸泡30 min,再在0.5×变性液中浸泡20min,即可进行Southern转印。

4 Southern转印

这里介绍两种常用的转印方法:毛细转印法和电转印法。

a毛细转印法

早期的Southern blot使用毛细转印法,经虹吸作用转移到NC(硝酸纤维)膜上。

按胶块大小剪取膜一张,在水中浸湿后,置于10×SSC中浸泡1 hr。剪去膜的一角,并将胶块切去一角,在10×SSC浸泡15 min2次。

用长和宽均大于凝胶的一块有机玻板作为平台,将其放入大的玻璃皿上,上面放一张Whatman滤纸,两端修剪后垂入玻璃皿中,倒入10×SSC至液面略低于玻板。将平台上方的滤纸湿透后,赶出所有气泡。

将凝胶翻转后置于平台上湿润的滤纸中央,滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。

X光片围绕凝胶四周,以此作为屏障,阻止液体自液池直接流至胶上方的纸巾。

在凝胶上方放置预先已浸湿的尼龙膜,排除膜与凝胶之间的气泡。

将二张已湿润的、与凝胶大小相同的滤纸置于膜的上方,排除滤纸与滤膜之间的气泡。

将一叠(5-8 cm厚)略小于滤纸的纸巾置于滤纸的上方,并在纸巾上方放一块玻璃,然后用一个重约500 g的重物压在玻璃板上。其目的是建立液体自液池经凝胶向膜上行流路,以带动凝胶中的DNA并使其聚集在膜上。

8 使上述DNA转移持续进行15 hr左右。在转膜过程中,当纸巾浸湿后,应更换新的纸巾。

9 DNA转移结束后,揭去凝胶上方的纸巾和滤纸。将膜在10×SSC中浸泡5 min,以去除膜上残留的凝胶。

10 将凝胶置于紫外灯下,观察胶块上有无残留的DNA

b电转印法

转印法经过改良后,快速简便的电转印法如今应用的更加普遍。

切除多余凝胶,在胶块下铺上60.5×TBE浸湿的滤纸,避免气泡;

裁剪一张与胶块同大小相同的尼龙膜或NC膜,用0.5×TBE浸湿后小心平铺在胶表面,除去凝胶和膜之间的气泡;

裁剪6张同样尺寸的滤纸,用0.5×TBE浸湿后平铺于膜上,去除气泡;

滤纸尼龙膜(NC膜)凝胶滤纸套装移入电转印仪中,膜面向阳极,凝胶面向阴极。室温下,100 mA转印60 min

5膜的固定

取出膜在2×SSC中浸泡20 min。将膜含DNA面朝上置于滤纸上,80 ℃烤膜30min。也可采用UV照射固定。

6杂交和洗膜

将膜放入杂交管内,加预杂交液60℃封闭4-6小时。倒出预杂交液,加杂交液与探针,60 ℃杂交过夜。次日,将膜放在洗膜液I 2×SSC0.1% SDS)中,室温洗2次,每次摇动10 min。再在洗膜液II0.5×SSC0.1%SDS)中漂洗2次,每次摇动20 min

7检测

将膜用dd H2O漂洗片刻,用保鲜膜将膜包好,置于暗盒中,在暗室中压上X光片。暗盒置-70 ℃放射自显影37天左右。

Northern Blot全流程解析

Northern印迹法(Northern blot),又称 RNA 印迹法,是生物化学、分子生物学中常用的实验方法,利用探针检测含有特定序列的RNA片段。由史丹佛大学的James Alwine和乔治斯塔克(George Stark)在1977年发明,其名字来源于Southern印迹法(命名者为Sir Edwin Southern)。Northern印迹法与Southern印迹法主要的不同之处是,Northern印迹法检测的是RNA分子而不是DNA分子;总RNA不需要进行酶切,即是以各个RNA分子的形式存在,可直接应用于电泳;此外,由于碱性溶液可使RNA水解,因此不进行碱变性,而是采用甲醛等进行变性电泳。与Southern印迹法相似,Northern印迹法中RNA样品经过凝胶电泳后会按照分子量大小分离,然后将样品从凝胶转印到膜(如尼龙膜、硝酸纤维膜等)上,并用与目标序列互补的标记探针检测。胶体可以选用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶,探针probe)是与目标序列互补的、由放射性(或非放射性)标记的RNADNA序列或寡核苷酸,探针至少要有25个碱基对与目标序列互补,最后进行放射自显影(或化学显影)。RNA样品通常以含甲醛的琼脂凝胶电泳来分离,甲醛作为RNA变性剂,将RNA的二级结构变性成一级结构。凝胶内用溴化乙锭(EtBr)染色,可在UV光下观察到RNA样品的品质、大小。实验结果可以根据所用探针的不同,以多种方式来观察。结果显示的是被检测的RNA条带的位置,即分子量大小;而条带的强度则与样品中目标RNA的含量相关。这一方法可以测量目标RNA在不同样品中的情况,因此已经被普遍应用于研究特定基因在生物体中表达的时间和表达量。

Northern blot基本过程

1RNA提取

50-100 mg组织置1.5 ml离心管中,加入1 ml Trizol充分匀浆,室温静置5 min;加入0.2 ml氯仿,振荡15 s,静置2 min4 ℃离心,12000 g×15 min,取上清;加入0.5 ml异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置10 min4 ℃离心,12000 g×10 min,弃上清;加入1 ml 75%乙醇,轻轻洗涤沉淀。4 ℃7500 g×5 min,弃上清;晾干,加入适量的DEPC H2O溶解(65 ℃促溶10-15 min)。也可使用RNA提取试剂盒,实验过程必须严格防止RNsae的污染。

2制备琼脂糖凝胶

取琼脂糖0.2 g,加入DEPC H2O 12.4 ml加热熔化,于55 ℃保温状态下加入甲醛凝胶电泳缓冲液4.0 ml37%甲醛3.6 ml,混匀、制胶。待胶体凝固后,置于甲醛凝胶电泳缓冲液中预电泳5 min

3样品制备:

取总RNA20 μg,加入甲醛凝胶电泳缓冲液4.0 μl、甲酰胺10 μl37%甲醛3.6 μl,加入DEPC H2O配置为统一体积,65 ℃温育15 min、冰浴5 min。加入EB1 μg/μl1 μl、上样缓冲液2 μl

4上样电泳:

上样,50 V电泳约2小时。电泳结束后将胶块置于紫外灯下,观察RNA是否降解,扫胶仪拍照记录18S28S条带的位置。

5 RNA从胶块转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜:

Southern印迹法一样,有两种转印方法:毛细转印法和电转印法。

a毛细转印法

按胶块大小剪取膜一张,在DEPC水中浸湿后,置于10×SSC中浸泡1 hr。剪去膜的一角,并将胶块切去一角,在10×SSC浸泡15min2次。

用长和宽均大于凝胶的一块有机玻板作为平台,将其放入大的玻璃皿上,上面放一张Whatman滤纸,两端修剪后垂入玻璃皿中,倒入10×SSC至液面略低于玻板。将平台上方的滤纸湿透后,赶出所有气泡。

将凝胶翻转后置于平台上湿润的滤纸中央,滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。

X光片围绕凝胶四周,以此作为屏障,阻止液体自液池直接流至胶上方的纸巾。

在凝胶上方放置预先已浸湿的尼龙膜,排除膜与凝胶之间的气泡。

将二张已湿润的、与凝胶大小相同的滤纸置于膜的上方,排除滤纸与滤膜之间的气泡。

将一叠(5-8 cm厚)略小于滤纸的纸巾置于滤纸的上方,并在纸巾上方放一块玻璃,然后用一个重约500 g的重物压在玻璃板上。其目的是建立液体自液池经凝胶向膜上行流路,以带动凝胶中的RNA并使其聚集在膜上。

8 使上述RNA转移持续进行15 hr左右。在转膜过程中,当纸巾浸湿后,应更换新的纸巾。

9 RNA转移结束后,揭去凝胶上方的纸巾和滤纸。将膜在10×SSC中浸泡5 min,以去除膜上残留的凝胶。

10 将凝胶置于紫外灯下,观察胶块上有无残留的RNA

b电转印法

经过改良后,快速简便的电转印法如今应用的更加普遍。

切除多余凝胶,在胶块下铺上60.5×TBE浸湿的滤纸,避免气泡;

裁剪一张与胶块同大小相同的硝酸纤维素膜或尼龙膜,用0.5×TBE浸湿后小心平铺在胶表面,除去凝胶和膜之间的气泡;

裁剪6张同样尺寸的滤纸,用0.5×TBE浸湿后平铺于膜上,去除气泡;

滤纸尼龙膜(NC膜)凝胶滤纸套装移入电转印仪中,膜面向阳极,凝胶面向阴极。室温下,100 mA转印60 min。实验过程必须严格防止RNsae的污染。

6膜的固定

膜置于80 ℃,真空干烤1-2 hr。烤干后的膜用塑料袋密封,4 ℃保存备用。也可采用UV照射固定。

7杂交和洗膜

探针标记:

取模板DNA 25 ng0.5 ml离心管中,95-100 ℃变性5 min,冰浴5 mindNTPmix的制备: dGTP 1 μldATP 1 μldTTP 1 μl混匀;将下列反应成份混合,加入离心管中:

dNTPmix 2.0 μlBSA(10 mg/ml ) 2.0 μl5×buffer 10.0 μlKlenow (5 u/μl) 1.0 μlα-32P-dCTP 5.0 μl

加入适量dd H2O使反应总体积达50 μl,轻轻混匀。室温下反应1 hr

预杂交:将膜的反面紧贴杂交瓶,加入预杂交液5 ml42 ℃预杂交3 hr

杂交:将变性的探针(95-100 ℃变性5 min,冰浴5 min)加入到预杂交液中,42 ℃杂交16 hr

洗膜:

倒去杂交液;2×SSC/0.1%SDS洗液I室温洗15 min0.2×SSC/0.1%SDS洗液II 55 ℃15 min×2次。

8检测

将膜用dd H2O漂洗片刻,用滤纸吸去膜上水份。用薄型塑料纸将膜包好,置于暗盒中,在暗室中压上X光片。暗盒置-70 ℃放射自显影37天左右。

影响Southern blot和Northern blot杂交的因素

1待检测核酸分子的浓度和长度

待检核酸分子浓度越大,探针与其结合速度越快,敏感性越高;待检核酸分子的分子量越大,转膜越困难,敏感性越低;经预实验后,选择最佳转膜方法。

2探针的性质(探针标记效率、浓度,核酸性质)

可分为放射性(或非放射性)标记的RNADNA序列或寡核苷酸。对于单链探针,浓度越高,杂交率越高;经预实验后,选择最佳的探针标记方法和检测方法。

3杂交液的离子强度

低盐浓度时杂交率较低,随着盐浓度增加,杂交率增加(Na+的作用);高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定,当进行不完全同源序列的杂交时,必须维持杂交液与洗膜液中较高的盐浓度。

4杂交液体积、杂交温度和时间

杂交液体积越小,杂交动力学越高;DNA/DNA杂交适宜的复性温度一般比Tm低2025 ℃;温度越低,非特异性越高;温度越高,敏感性越低。

5非特异性杂交反应

进行杂交前,需封闭膜上非特异的杂交位点,减少其对探针的非特异性吸附。

6杂交后的漂洗

需注意洗液的盐浓度、洗脱温度、洗脱次数、洗脱液体积。

7固相膜的选择

Southern blot宜采用阳离子尼龙膜,Northern blot宜采用硝酸纤维素膜或尼龙膜。

小编点评

技术在手,文章我有!今天我们介绍了Southern blotNorthern blot的实验步骤与注意事项,同大家分享经验,希望我们都能获得漂亮的结果!

本文涉及到的部分参考文献:

1 Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J. Raff, M., Roberts, K., Walter: Molecular Biology of the Cell.

2 Kevil, C. G., Walsh, L., Laroux, F. S., Kalogeris, T., Grisham, M. B., Alexander, J. S. : An Improved, Rapid Northern Protocol. 

3 Bor, Y.C.; Swartz, J.; Li, Y.; Coyle, J.; Rekosh, D.; Hammarskjold, Marie-Louise: Northern Blot analysis of mRNA from mammalian polyribosomes.

4 Southern, Edwin Mellor :Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresi.

5 Towbin; Staehelin, T; Gordon, JElectrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.

6 Burnette, W. Neal Western Blotting: Electrophoretic Transfer of Proteins from Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels to Unmodified Nitrocellulose and Radiographic Detection with Antibody and Radioiodinated Protein A.

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