新型冠状病毒qPCR检测的一点拙见

 我是突然萌生了想写点什么的念头。

       新年的喜庆撞上了添乱的新型冠状病毒,被打了个措手不及;事实证明,即便有着SARS的惨痛经历,但我们的准备仍然不足,包括物资,包括心理。能为这场持久战献上这点绵薄之力,是我为数不多的能做得到的。

       就病毒而言,核酸检测是最灵敏、特异性最高的一种方法,可能在血清学标志物出现之前就可以检出核酸。唯一需要注意的就是可能出现的变异会导致PCR检测方法失效,这时候测序作为“金标准”就可以派上用场了,只不过由于特需的设备和周期长门槛高的数据分析而不适合大规模的筛查。

       目前官方认可的三款检测试剂盒都是采用ReverseTranscription (RT)-qPCR方法进行检测。好多媒体解读的检测盒短缺是由于产能的问题,这应该不是实情,现在探针引物的大批量合成技术非常成熟,且耗时很短(通常小于2d),一次小批量合成即可满足上千人份的检测。最大的制约因素可能在物流运输上。

       检测试剂盒短缺就意味着只能优先满足高度疑似患者,但最新消息表明新型冠状病毒的潜伏期在10-14d,而在潜伏期(也就是无症状期)就已具备传染能力(这时病毒的拷贝数已经很高了),所以必然会遗漏大批的无症状病毒携带者,这才是最大的风险。如果能够解决短缺问题,接下来一定要将检测筛选范围扩大到所有的疑似患者乃至医学观察期人员。

       下面我会从样本运输、核酸提取、RT-qPCR及数据解读方面给出一些建议,这些建议仍不成熟,仅供相关检测技术人员参考。

       

样本运输

Ø 样本的运输必须按照相关规定严格执行,一旦发生样本泄露,保护好自己和他人的前提下紧急处置。

Ø  由于很多检测工作已经下放到县市级机构,长距离运输样本不可避免,保存温度最好能维持4℃。好在现在是冬天,而且完好的病毒其RNA由包裹的蛋白外壳保护一般不会降解。

核酸提取

Ø 生物安全第一位。阳性样本具有极强的传染性,无论是上呼吸道黏液、血液还是其他类型样本。核酸提取不可避免需要直接接触样本,必要的防护是绝不可少的。事实上,目前检测工作的滞后很大程度是由于县市级机构实验室条件达不到要求。

Ø 要采用指定的RNA提取试剂盒。检测试剂盒的说明书中一般都会指定提取试剂盒的规格和品牌,不同品牌之间的性能表现是不一样的,比如回收率、纯度等,这些都会影响下游的RT-qPCR检测。

Ø 最后尽量用少体积的DEPC水溶解。RNA提取试剂盒一般会给出ElutionVolume (EV)的参考范围,对于柱纯化方法,EV太大会降低RNA的浓度,从而一定程度上降低了检出灵敏度;适当减小EV,并重复一次Elution操作,既可以提高RNA浓度,也同时保证了回收率。

RT-qPCR及数据解读

Ø 严格按照检测试剂盒说明书配制PCR反应体系。试剂盒研发过程中已经对反应各组分进行了优化,如果试剂配比发生错误甚至会导致PCR反应失败或者Cq偏大,导致假阴性。

Ø 选择恰当的荧光通道。试剂盒说明书会指定检测的重数(1重到3重)和荧光分子的类型,FAM是最常用的。目前市面的qPCR仪器一般至少都是双通道,第一通道都是检测FAM信号,第二通道一般都是对应HEX、VIC和JOE信号。如果是3重检测的试剂盒,第三个荧光分子选用的是TEXAS RED,在常见的qPCR设备中对应的通道不同。ABI的7500系列对应第四通道,Roche的LC96和Bio-Rad的CFX96对应的是第三通道。选错通道会导致检测失败,必要时要和厂家的技术支持进行确认。

Ø 灰区结果的判读。不同试剂盒的结果判读标准也不一样,阳性和阴性结果的判读比较明确,当Cq值落在灰区(比如37-40)时,一般需要复测才能确定;如果试剂盒短缺,复测难以实现时,建议以阳性样本处理。原因有两点:这种检测的假阴性的代价太大,而且PCR试剂盒研发会对特异性进行特殊考量。当Cq是38时,有很大的概率就是阳性样本。当然,这种判断是基于实验室环境无污染、操作规范的前提。

       真心的希望这些尚不完备的建议能够帮到检测技术人员,在保护好自己的前提下,将检测工作尽可能规范化,为处于焦虑的疑似者带去一丝慰藉,无论是未感染的还是确诊的。

       记于2020年这个不平凡的春节。

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