方法论:基因编辑的未来之星“Base Editor”

       说到基因编辑,最耳熟能详的莫过于CRISPR–Cas9这个明星技术了。自2012年正式进入到基因编辑这个领域[1]以来,CRISPR–Cas9因其强大的编辑效率、简单易行的操作而深受科研工作者的青睐,其有效性也在各个物种的实验中得到了印证。然而,当人们把目光聚焦在人类遗传病的治疗方向上时,这个强大工具却显得有些“力不从心”。人类遗传病中的大部分都是由于发生点突变造成的,CRISPR–Cas9在修复这些点突变时经常会出现效率偏低、生物安全性低等问题,而这一僵局直到Base Editor的出现才得以打破。           

什么是Base Editor

       2019年11月18日,Nature Technology Feature刊发了一篇报道,详细论述了Base Editor的特点和应用[2]。Base Editor利用Cas系统的定位和切割功能实现单碱基的精确替换,这一技术在2016年由Broad 研究所 David R. Liu 教授首度报道,开发出胞嘧啶碱基编辑工具 (Cytidine base editors, CBEs)[3]

      CBEs系统的Cas9 保留了可被 sgRNA 引导定位到 DNA 靶位点的能力,但不会对 DNA 双链进行剪切,共表达的胞苷脱氨酶直接将目标胞苷转化为尿苷,然后利用DNA 修复机制将尿嘧啶转化为胸腺嘧啶,可在不对 DNA 双链进行切割的条件下完成将G/C 碱基转换成 A/T 碱基。

图片来自于参考文献3.

      2017年,同样来自于DavidR. Liu实验室的Nicole Gaudelli开发出第一个腺嘌呤碱基编辑工具(Adeninebase editors, ABEs),创造性的实现了A/T 碱基到G/C碱基的化学转换[4]。与CBE相比,ABE的开发难度更大,原因在于自然界中不存在天然的将A转换成G的酶。经过七轮的蛋白进化筛选,终于得到一种来自于细菌的TadA,它可以在一些RNA中将A转换成G,同时能够以DNA为底物。这个酶将靶标腺嘌呤转换成肌苷,并在DNA复制过程中被细胞当做G,从而实现了编辑替换的目的。

图片来自于参考文献4.

        单碱基编辑的胜利战果在2019年10月得到进一步扩大。David R. Liu开发了一种新型的基因编辑工具——Prime Editor,可以在且不需要DNA 双链断裂(DSB)和供体 DNA 作为模板的前提下实现所有的12种点突变[5]。PE系统利用guide RNA和Cas9切割酶将反转录酶定位到靶点处,以RNA为模板反转录出DNA并将其插入到断点处。但这个系统的应用仍有很多工作要做,比如能否在动物细胞及各种细胞系中像单碱基编辑那样操作简单有效。

图片来自于参考文献5.

Base Editor的优势

     相较于传统的CRISPR–Cas9,Base Editor有以下优势:

       I.        编辑效率更高。在细胞系中编辑效率高达40%-50%,远高于CRISPR-Cas9的5%左右(data not shown)。

     II.        生物安全性更高。相较于CRISPR-Cas9需要引发DSB,可能引发细胞未知形式修复形式如indels,Base Editor在编辑过程中只需要断裂DNA单链,因此生物安全性更高。CBEs可以修复小鼠和人细胞系中与阿尔茨海默和癌症相关的点突变,效率高达35%-75%,而indels概率仅仅为5%;CRISPR-Cas9效率仅仅为0.1%-0.3%,而indels概率高达26%-40%[3]

Base Editor的局限性

       在应用上,目前Base Editor最大的限制因素在于特异性。CBEs系统中应用的脱氨酶可以催化所有的C碱基,且与底物的结合能力较强,因此脱靶效应比较明显。ABEs系统中应用的TadA虽然对底物A碱基也无选择性,但其结合能力较弱,因此需要Cas9的辅助定位才能实现催化反应,所以ABEs系统似乎并没有显示出那么多的“脱靶效应”。

       另外,Base Editor的“编辑框”——有效编辑的区域,会比较宽泛;当我们要求只编辑某一个特定的碱基A时,那我们并不想看到它紧邻着的A碱基发生了编辑。当时,宽泛的编辑框也并非一无是处。有时我们需要对某一特定区域的某几个碱基同时进行编辑,那么这将成为一大优势。编辑框的范围能够随着我们的目标而相应变化,这是将来努力的方向。

       目前,Base Editor在人类基因组上能够有效编辑的范围仍然有限,这受限于其“导航系统”Cas9需要依赖原间隔序列临近基序PAM,如何对Cas9进行定向进化筛选以获得兼容更多PAM序列的变体成为改进的策略之一。

基因编辑的发展前景

       尽管Base Editor有一定的局限性,但它仍然是最有潜力的能够应用到临床中的“未来之星”。它在实践操作上的门槛很低,和CRISPR-Cas9一样简单,能够被科学家们快速掌握并应用。目前Base Editor已应用在细菌、酵母、水稻、小麦、小鼠、斑马鱼、兔子和猴子等多个物种中并取得良好效果,通过基因的编辑获得新的动物模型。

      CRISPR-Cas9、Base Editor和PrimeEditor各有特点,其应用上恰好取长补短。CRISPR-Cas9适合大片段的插入和敲除操作,像一把剪刀;PrimeEditor在DNA的插入敲除和单碱基编辑方面的灵活性最高,如同一台打字机;BaseEditor是单碱基编辑的最佳利器,且不容易犯错,精细程度如一支铅笔。尽管在临床应用上有很长的一段路要走,比如要解决AAV有效转染的问题,但是在可期的未来,Base Editor一定会在治疗人类遗传病中大放异彩。

参考文献

1. Jinek, Martin, et al. “A programmable dual-RNA–guided DNA endonucleasein adaptive bacterial immunity.” science 337.6096 (2012):816-821.

2. Sandeep Ravindran. “Got mutation? ‘Base editors’ fix genomes onenucleotide at a time” Nature 575, 553-555 (2019)

3. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A. & Liu, D.R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-strandedDNA cleavage. Nature 533, 420 – 424(2016).

4. Gaudelli, N. M. et al. Programmable base editing of A*T to G*C ingenomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464 – 47 (2017).

5. Anzalone, Andrew V., et al. “Search-and-replace genome editingwithout double-strand breaks or donor DNA.” Nature (2019): 1-1.

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