玩转qPCR系列:核酸样本的质控

      上一期讨论了样本获取和核酸提取,本期聚焦在提取的核酸样本的质量控制。

      qPCR实验中,核酸样本从组成上可分为两类:RNA和DNA,前者用于基因表达和lncRNA等的定量,后者用于常规的SNP和CNV等实验。接下来也是按照这个分类进行讨论。

 

RNA

RNA浓度

       研究基因表达时,建议所有的样本加入RNA的量大体一致,以便在同一水平进行比较。即便通常使用内参基因进行均一化,但加入的RNA总量差别太大依然会对结果造成一定影响。因此,RNA定量工作就显得比较重要了。可选的方法有紫外吸光度法(如ThermoScientific NanoDrop)、微流控分析(如AgilentBioanalyzer)和荧光检测法(如ThermoScientific RiboGreen)。其中荧光检测法相对特异性更好,能够更准确的定量低浓度RNA样本(Fig 1)。无论采用何种方法,实验中所有样本都必须采用同一种方法;与此同时,不同的方法得到的定量结果是不具有可比性的[1]。最后,在文章中要注明RNA浓度及采用的测量方法。

     

       Figure 1. 75nM RiboGreen对低浓度范围RNA的灵敏检测[2].

基因组DNA污染

        上一期讲过在RNA纯化过程中要加入DNase I进行消化。即便如此,基因组DNA污染仍然是基因表达中常常碰到的干扰,造成表达水平假性增高。评价基因组DNA污染时需要设定一个容忍的阈值,超过此限度就要考虑重新消化或者提取操作。基因表达实验中No-RT control(无反转录对照)是评价手段之一,可以根据Cq值大小设定容忍阈值。另外,之前推送的关于引物设计操作的文章中讲过,跨内含子设计可以很大程度避免基因组污染带来的影响(Fig 2)。最后的结果要报告基因组污染的容忍程度及评估方法。

Figure 2. 跨内含子引物可有效减少gDNA的影响[3].

RNA完整度

        RNA的降解是另外一个“棘手”的问题。当保存条件不当或者有RNase存在时,都会造成很大程度的RNA降解。最常用的评估方法就是用微流控芯片来测量rRNA的完整度和丰度,从而得到一个表征参数RNA Integrity Number(RIN,Fig4)[4]RIN越高,表示完整度越好。还有一种策略是Reference gene 3’/5’integrity assay,在reference gene的3’和5’端分别设计一对PCR引物,当mRNA完整度不高时,以oligo dT为引物进行反转录时就会中断,导致5’端cDNA数量少于3’端cDNA[5]。采用该方法的前提是5’和3’的扩增效率是一致的,且不会被抑制物不同程度地抑制。论文中要提供详细的评估方法和结果。

Figure 3. 不同的RIN对应不同程度地rRNA降解.

RNA纯度

       除了基因组DNA污染,RNA样本中还可能残存蛋白质和酚类物质等,很多科研工作者都习惯采用紫外吸光度来评估。较纯净的RNA其A260/A280和A260/A230都应该大于等于2.0,但这两个值只是有一定的指示作用,并不能很好的反映其纯度。这是因为降解后的核酸260nm吸光度会提高,而且仅通过吸光度来判断蛋白质还是酚类污染特异性不高,很容易受到别的物质干扰,因此更推荐用凝胶电泳的方法来进行评估。

抑制物评估

       RNA样本中存在的抑制物会降低反转录酶及DNA聚合酶的工作效率,导致Cq值偏大。可以采用一种叫做“SPUD”的方法来对抑制程度进行评估,对externalDNA control(与实验物种的DNA无同源性)进行扩增,分别加入等量的水(作为阴性对照)和RNA样本,如果存在抑制物,后者的Cq就会偏大,因此可以通过Cq的差异来评估抑制程度[6]

DNA

       DNA相比RNA更稳定,因此降解的风险低得多。因此对于DNA样本而言,更重要的是其浓度的定量和抑制程度的评估,方法仍可参照RNA样本的方法。值得一提的是,抑制程度的评估更推荐用梯度稀释来做标准曲线的方法,毕竟,不同位点的扩增对抑制物的耐受程度可能不同[7]

 

       最后要提醒的是,RNA样本如果质量很差,要仔细评估对结果带来的影响,不能盲目往下进行实验,而要分析可能的原因,在条件允许的情况下重新提取核酸;另外对于一些特殊的实验,比如实验对象是单细胞、CTC等微量细胞时,提取的RNA量可能满足不了所有的质控环节,这时要做权衡和取舍。

       下一期将讨论非常关键的第一轮反应——反转录。

参考文献

1. Bustin,Stephen A. “Real-time, fluorescence-based quantitative PCR: a snapshot ofcurrent procedures and preferences.” Expert review of moleculardiagnostics 5.4 (2005): 493-498.

2. Jones,Laurie J., et al. “RNA quantitation by fluorescence-based solution assay:RiboGreen reagent characterization.” Analytical biochemistry 265.2 (1998):368-374.

3. Padhi,Bhaja K., et al. “A PCR-based approach to assess genomic DNA contaminationin RNA: application to rat RNA samples.” Analytical biochemistry 494(2016): 49-51.

4.  Schroeder,Andreas, et al. “The RIN: an RNA integrity number for assigning integrityvalues to RNA measurements.” BMC molecular biology 7.1 (2006): 3.

5. Vermeulen,Joelle, et al. “Measurable impact of RNA quality on gene expressionresults from quantitative PCR.” Nucleic acids research 39.9 (2011):e63-e63.

6. Nolan,Tania, et al. “SPUD: a quantitative PCR assay for the detection ofinhibitors in nucleic acid preparations.” Analytical biochemistry 351.2(2006): 308-310.

7. Huggett,Jim F., et al. “Differential susceptibility of PCR reactions toinhibitors: an important and unrecognised phenomenon.” BMC research notes1.1 (2008): 70.

基础实验

玩转qPCR系列:论“科学的取材”

2020-8-14 22:24:46

基础实验

玩转qPCR系列:qPCR体系与运行程序

2020-8-14 22:25:01

加入Q群
0 条回复 A文章作者 M管理员
    暂无讨论,说说你的看法吧
个人中心
今日签到
有新私信 私信列表
搜索