玩转qPCR系列:反转录——第一道关口(1)

       上一期的关注点是核酸样本的质控,质控评估合格之后,接下来要进入到qRT-PCR实验中极其关键的第一个反应——反转录,也是本期要讨论的部分。

       反转录反应的描述很简单,就是RNA转化变成complementary DNA(cDNA)的过程。然而,这个过程相对DNA复制反应更复杂,涉及更多的组分。事实上,在整个实验的variation中,反转录过程占据了相当大的比重;因此要做好基因表达实验,这个过程的很多细节都要研究透。

       接下来会从反转录酶、RNA的量、mRNA靶点位置、引物策略、反应条件及样本保存这几个维度展开。

 

反转录酶

       目前市面上的反转录酶绝大部分来自于莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)和禽成髓细胞瘤病毒(AMV),当然或多或少的都经过了改造。不同的酶具有不同的功能活性,适合不同类型的RNA模板,比如高GC含量的或者富含二级结构的。另外,有的会附带RNase H活性,能够切割mRNA:cDNA杂交链中的mRNA,提高后续qPCR检测的灵敏度;也有的工程酶特意将其失活,从而可以得到更长的cDNA产物,适合长片段基因的克隆表达,但对qPCR反应可能意义不大,因为qPCR的产物长度一般控制在200 bp以内,并不需要这么长的转录物。

       评价哪一款反转录酶最适合你的实验,要从产量、重复性和线性范围几个方面进行考量。建议先测试3-4款反转录酶,最好是不同厂家的,且各有特点。每一种反转录酶做3-4个技术重复,靶标基因和内参基因都要测试,其他反应条件均保持一致,如引物策略、温度和后续的qPCR反应等,最后比较MeanCq和SDCq的大小。假定测试了8种反转录酶和6个基因,其中β-actin和GAPDH为内参基因,其余4个为内参基因,结果如Fig1所示。综合来看,代号为Super的酶产量最高,AMV最差;重复性上表现都比较相近,除了HTR2a基因,这可能是由于本身表达量很低造成的[1]。因此在该实验的最佳选择就是Super酶。最后,文章方法中应注明使用的酶的名称、厂家和工作浓度。

Figure 1. 8种反转录酶的产量及重复性测试[1].

        每种酶对应的工作线性范围千差万别,而了解线性范围会使我们对RNA的加样量更有信心。通常做法是从一个高浓度赋值样本出发,稀释5-6个点,每次4-5倍,每个点3-4个重复。比如从1000 ng/μl到1 ng/μl,从拟合的标准曲线中挑取R2值最大且范围也较广的所对应的反转录酶。R2值是需要优先保证的,适当的舍弃极端浓度点会提高R2值。值得注意的是,稀释介质不能用水,需要用核酸介质(如不同物种的tRNA)来保证每个稀释梯度的总RNA浓度是一致的,这是因为用水来做稀释会导致标准曲线线性拟合效果很差(Fig 2)[2]

Figure 2. 总RNA分别使用水和酵母tRNA稀释做出的五个基因表达量的标准曲线[2].

RNA的量

       如果要做的靶标基因数量很多,那一次反转录中要多加一些RNA,但也不要超过线性范围的上限,获得的cDNA样本取一小部分进行后续试验(稀释与否视基因表达丰度高低而定)。如果采取一步法,也就是反转录与qPCR在同一个体系中完成,那RNA的加样量就要根据预估的基因表达丰度来定,在满足线性范围及”RNA原料充足“的前提下,适当多加一些可以提高数据的精密度[3]无论最后确定加入多少RNA,建议所有样本都要参照实行,这样可以提高数据的可比性。

mRNA靶点位置

       做基因表达实验时,更推荐在mRNA的3’端附近设计扩增片段,尤其是采用Oligo dT作为反转录引物(下一期会讨论引物策略)时。通常会期望反转录时能够将全长的RNA片段都转化成cDNA,但实际上这是不现实的。当mRNA很长时,反转录酶往往走不到5’端就会掉落,这跟普通的DNA Taq酶很难克隆扩增长片段是一个道理。然而,有时在3’端设计扩增片段是不合适的,这时需要衡量反转录的长度及mRNA完整性。通过在两端分别设计扩增位点来比较Cq的差异,就可以对cDNA的完整程度有一个大概的把握(Fig 3)[3]最后,无论使用哪种引物策略,都推荐做一下不同扩增位置的对比试验,以免其带来的误差导致数据的偏倚。

Figure 3. 不同扩增位置对结果的影响[3]。 RS和V是两种反

转录酶

       下一期讨论剩下的引物策略、反应条件和保存等因素。

 

参考文献

1.  Ståhlberg,Anders, Mikael Kubista, and Michael Pfaffl. “Comparison of reversetranscriptases in gene expression analysis.” Clinical chemistry 50.9 (2004):1678-1680.

2.   Ståhlberg,Anders, et al. “Properties of the reverse transcription reaction in mRNAquantification.” Clinical chemistry 50.3 (2004): 509-515.

3.   Bustin,Stephen, et al. “Variability of the reverse transcription step: practicalimplications.” Clinical Chemistry 61.1 (2015): 202-212.

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2020-8-14 22:20:43

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