方法论:新冠大流行 Sherlock技术能否依旧神勇

       今年的新冠疫情已在全球造成426万人感染,近30万人死亡。从目前的疫情走势、治疗和预防的棘手程度来看,这次新冠疫情绝对算是近代以来最严重的一次公共卫生危机。

       5月11日,Nature报导FDA紧急批准了第一个CRISPR检测试剂盒,用于缓解美国目前公共检测的紧急需求(Fig 1)。该试剂盒是由Sherlock Bioscience公司开发,也是基于核酸检测,但这次并不是靠依赖DNA聚合酶的PCR反应,而是依靠CRISPR-Cas相关的酶。                         

Figure 1.Nature报导的美国第一个CRISPR新冠检测试剂盒

       要了解这个试剂盒有何新颖之处,其检测性能表现如何,还是要从其技术原理谈起;事实上,这不是一个新技术了,Broad研究所的张峰实验室在2017年最早提出这一技术,并取名“夏洛克”[1],意为能从大量“群众分子”中揪出个别“犯罪分子”的神探。光听名字,其灵敏度就低不了。

 

技术起底

      这个技术的主角是CRISPR-Cas13a(也叫C2c2),它携带着“犯罪分子”的特征信息(crRNA),一旦与靶标分子匹配(序列互补配对),它会行使核酸酶活性,无差别的水解RNA探针,从而释放出荧光基团发出荧光(Fig 2)。

Figure 2.Sherlock原理示意图

       这个原理是很好理解的,但存在的问题是,如果靶标分子太少,cas13a得水解多少探针才能释放出足够的荧光信号?于是在前处理时加入了RPA等温扩增的程序,用于提高靶标分子的数量,同时文章中也比较了预扩增对灵敏度的影响,接近7-8个数量级的差异(Fig 3),由此可见预扩增的必要性。与此同时,由于预扩增,这个技术只能进行定性检测。事实上,公共卫生中的病毒检测也不需要精确定量。

Figure 3. 预扩增对于检测灵敏度的影响。Cas13a数据点即

不进行预扩增的情况。

       说到底,Sherlock就是预扩增加cas13a识别后切割的技术组合,RNA和DNA都可以检测。预扩增之所以选择RPA技术,主要是考虑到现场检测的便利性,可操作性强。

 

性能指标

       灵敏度测试  文章中以寨卡病毒为例对Sherlock进行测试,以人血清或尿液作为样本,可检出低至2.1 aM的寨卡病毒RNA,即1.25 copy/μl的浓度(Fig 4)。这个灵敏度已经非常可观,甚至优于qPCR的灵敏度,完全可以满足公共卫生的日常检测。

Figure 4.Sherlock对样本中寨卡病毒的检测

        特异性测试 设计上最大的难点在这里,因为要测试Sherlock对碱基错配的容忍程度。作者为降低容错率,特意在crRNA中引入单碱基突变,测试不同长度crRNA及不同位置的单碱基错配对WT(ssRNA1)和MT(ssRNA2)识别的影响(Fig 5)。可以看出每个长度crRNA的关键碱基位置都是3’端5号位碱基,同时20-23nt的长度都是合适的。因此在设计上,要将重点区分的单碱基位置放置在3号位,同时在5号位上人为引入突变。接下来以近源的寨卡病毒毒株和登革热病毒毒株为例,对特异性进行测试,Sherlock也展现出良好的区分能力。

Figure 5. 不同设计的Sherlock的对SNP片段的区分识别能力   

  

优势劣势

       Sherlock的优势显而易见:I. 灵敏度特异性足够的好,这是前提;II. 没有仪器硬件要求,非常适合现场检测,这是应对公共卫生事件进行普筛工作的一大优势;III.酶及试剂为干粉状,适合长期保存而无明显效力损失;IV. 可做成试纸条,人人可进行操作,如同测早早孕一样简单。

       要说其劣势,那就是前期开发的难度较大,需要测试不同的crRNA设计。要知道,寨卡病毒检测试剂盒的设计思路,未必一定适合COVID-19。不同的序列,不同的样本类型,可能带来更多的挑战。这次的COVID-19检测试剂盒并没有披露其具体的性能指标,而且近几个月如潮水般涌现的qPCR检测试剂盒相对更容易开发,但也并没有展现出和厂家宣传一样的性能,因此我也对Sherlock检测试剂盒持谨慎乐观态度,只能说以观后效了。

 

继承发展

       2018年,同样来自于张锋实验室的Gootenberg等人在此基础上开发了第二代Sherlock,最大的特色是利用不同cas13a及cas 13b蛋白家族成员的特点实现了多重检测(Fig 6)[2]。同年,Daniel S. Chertow回顾了利用CRISPR-Cas蛋白家族开发的一系列核酸检测工具,在传染病等临床检测及诊断中具有很好的发展前景[3]。2019年,张锋实验室发表了Sherlock开发设计的step-by-step protocol,为其他研究者提供了依据和参考[4]

Figure 6.Sherlock version 2原理示意图

      

       新颖工具酶的出现和开发,极大的推动了分子生物学的变革与进步,直到今天我们仍在受益。Sherlock,这是一个未来可期的技术,让我们拭目以待。

 

参考文献

1.     Gootenberg,Jonathan S., et al. “Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2 “Science 356.6336 (2017): 438-442.

2.     Gootenberg,Jonathan S., et al. “Multiplexed and portable nucleic acid detectionplatform with Cas13, Cas12a, and Csm6.” Science 360.6387 (2018): 439-444.

3.     Chertow,Daniel S. “Next-generation diagnostics with CRISPR.” Science 360.6387(2018): 381-382.

4.     Kellner,Max J., et al. “SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPRnucleases.” Nature protocols 14.10 (2019): 2986-3012.

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