玩转qPCR系列:引物与探针信息

       上一期介绍了如何提供完备的基因信息,本期的内容是相似的,只不过是对象换成了设计的引物和探针(如果使用探针法)。

 

序列信息

       前面的推送中我们讨论过设计探针和引物的一些原则和示范,无论采用哪个工具进行的设计工作,都应该保留一些相关信息,如特异性分析等。当然,最重要的是引物和探针的序列信息,一般从5’端到3’端顺序书写。很多常见位点的引物和探针序列在RTPrimerDB网站上都可以查询的到,如人的ACTB(Fig 1)。每个基因可能不止一种设计方案,如人的ACTB就有50多种,探针法(TQ)和染料法(SYB)都在其中。具体选择哪一种方案要根据其文献出处(网站有提供)来比较和衡量,但大多数情况下都是通用的。推荐尽可能的采用已上传到该网站并得到验证的引物和探针序列,可以最大程度的保证扩增效果。当采用该网站上的方案时,要备注ID号(Fig 1中红框所示)。       

Figure 1. RTPrimerDB中探针与引物的设计方案示意

      当采用预制的assay(如乙肝病毒检测试剂盒)时,很可能无法提供详细的序列信息,因为这属于商业机密,公司一般不会提供。这种情况下,要在文章中备注使用assay的全称、货号及生产厂家。

匹配位置及修饰信息

       设计好引物和探针后,一般要对其匹配的位置进行描述或者画图示意(Fig1中绿框所示),以方便读者一目了然。

       引物的修饰方式有很多,如地高辛标记、生物素标记和氨基修饰等,但一般是用于非放射性免疫分析及杂交等实验。在常规的RT-qPCR实验中,通常不会对引物进行修饰。探针最主要的修饰信息是5‘端的荧光基团和3’端的淬灭基团,荧光基团的选择要根据仪器通道配置来选择,淬灭基团的选择要根据荧光基团的发射光谱,可以最大程度的降低背景荧光值。另外,为达到特定的应用效果,探针的碱基也有可能发生修饰,如对SNP位点进行PNA或LNA核酸类似物置换,从而降低错配发生概率。

生产厂家及纯化方式

       有人可能认为国外厂家合成的引物或者探针质量比国内厂家要好,其实有些以偏概全;就RT-qPCR而言,对引物和探针质量的要求并没有像其他应用那么高,无论国产还是进口,绝大部分情况下应该都是可以满足的。如果你碰巧国内厂家合成的没有扩出来,国外厂家合成的成功了,那也只能说明你的“运气”太好,不足以得出质量差别的结论。事实上,现在大家更看重货期,这时国内合成公司就占有很大优势。

       纯化方式有很多种,如脱盐、PAGE和HPLC等,在引物或者探针合成单上有标注。一般脱盐纯化的引物即可满足qPCR实验,如果不那么看重成本(其实也没有贵多少),更推荐使用PAGE纯化,纯度更高一些。探针尽量选择PAGE纯化。

 

      下一期介绍qPCR的实验条件,除了引物和探针,还有更多的组分值得关注。

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