玩转qPCR系列:qPCR体系与运行程序

       上一期介绍了如何提供引物和探针的信息,本期的内容是与qPCR的mix体系及扩增程序相关的。

 

Mix体系

       qPCR的体系配制其实与常规的PCR体系是类似的,也包含了buffer、dNTP、DNA聚合酶、引物及模板,不同的地方在于qPCR体系还多了荧光标记(如SYBR Green I或probe)。所有的组分都要提供浓度信息,这对重复qPCR实验至关重要。Buffer中除了缓冲成分,最重要的就是Mg2+,是DNA聚合酶活性的必要条件。DNA聚合酶除了浓度信息之外还要提供使用的聚合酶名称,如常规的Taq酶或者经过基因改造后具有更多其他特性的聚合酶,使用不同的酶做出的实验结果也不尽相同。引物的使用终浓度一般在100-600nM,探针的使用终浓度一般在200-400 nM。浓度太高易出现非特异扩增,太低则导致过低的扩增效率;因此最佳浓度要根据自己的实验来定,推荐前期预实验可以做一下浓度梯度的探索。

       目前,大部分的qPCR实验都会选择使用各种kit,一般会提供2 x qPCR mix,里面预混了DNA聚合酶、SYBR Green I(染料法)、buffer、Mg2+和dNTP等,用户只需要加引物和模板即可。Kit说明书中一般不会提供各个组分的浓度信息,这种情况下,要备注kit的名称及生产厂家,同时,如果不是参照说明书中的配制方法,则要对改动的地方加以说明。

       qPCR反应体系中有可能会用到各种添加剂,如DMSO、甜菜碱和BSA等,无非是要提高扩增效率或者反应特异性,如果用到添加剂也要备注工作浓度。值得注意的是有些添加剂对聚合酶是有毒性的,要在其正面和负面作用之间取得平衡,浓度梯度实验是有效的方法之一。

      qPCR的反应体系一般在20-50 μl,常规采用20μl。尽量不要使用10 μl体系,加样不易控制且容易挥发,造成variation变大。

耗材及仪器

      qPCR板材往往是实验者容易忽略的点。当采用96孔板时,要注意qPCR仪器的兼容类型:全裙边、半裙边及无裙边等。更推荐使用白色管而非透明管,这是因为白色对荧光的反射更彻底,反映在结果上是Cq值更小,从而一定程度上提高了检测的灵敏度,但要注意这对扩增效率是没有影响的[1]唯一的弊端就是,看不到加样位置,也无法辨别是否有气泡,所以使用白色管时检测前要高速离心。

      封膜也是要注意的细节,尽量采用热封,而不要使用粘性膜。手工封膜有可能密封不严,导致技术学重复之间的variation比较大[1]

      qPCR仪器种类繁多,国产的,进口的,深孔的,常规的,等等。要备注使用的仪器型号及生产厂家,这是因为不同的设备做出来的结果很有可能是不同的。特别要注意的是,不同设备做出来的Cq值是没有可比性的,不能通过单纯比较Cq的大小来评判设备的灵敏度等性能指标,而要综合标准曲线等其他因素来衡量。

扩增程序

       qPCR程序与常规PCR程序基本相同,只是多了读板的操作。预变性一般采用95℃或者98℃,3-10 min即可,这里取决于模板的高级结构数量及GC%。循环步骤中采用两步法或者三步法,三步法的扩增效率相对较高,但当退火温度较高(>60℃)时,可将退火和延伸合并成一步,节省时间。对于qPCR产物而言,30-60s的延伸时间已经足够。无论采用两步法或者三步法,读板一般都是设置在循环的最后一步。循环之后一般无需终延伸和16℃保存等步骤,因为前面信号读取步骤已经结束了。

       再次提醒大家,qPCR仪尽量不要使用4℃。两点原因,一是没有必要,DNA产物相当稳定,16℃足矣;二是长期维持4℃对qPCR制冷模块是很大的负担,会减少使用寿命,毕竟这不是冰箱。

 

       下一期我们介绍qPCR的验证环节,再加上后面的数据分析,比较难的部分即将到来,敬请期待。

 

参考文献

1.  Reiter M, Pfaffl M.Effects of plate position, plate type and sealing systems on real-time PCRresults. Biotechnol Biotechnol Equip 2008;22: 824–8.

基础实验

玩转qPCR系列:核酸样本的质控

2020-8-14 22:24:53

基础实验

玩转qPCR系列:qPCR的性能指标

2020-8-14 22:25:09

加入Q群
0 条回复 A文章作者 M管理员
    暂无讨论,说说你的看法吧
个人中心
今日签到
有新私信 私信列表
搜索