玩转qPCR系列:qPCR的性能指标

       上一期介绍了如何提供体系配制及运行程序的相关信息,原本计划本期的内容继续推送qPCR验证及质控方面的内容,但考虑到其中涉及很多性能指标的术语,因此决定先将这部分背景补齐。

       本期的很多内容参考CLSI document EP17-A2,大家感兴趣可以查阅。

 

LOB

       Limit of Blank,即空白限,是指在一定的概率(1-α)下测量空白样本可能得到的最大值(Fig 1)。α即假阳性率,常规选定0.05,因此常常写作“LOB0.05”或“LOB95%”。qPCR中一般较少涉及LOB,除了试剂盒研发。LOB的确定要使用空白样本,也就是不含靶标分子的样本,但要求其基质组分与待测样本相似,因此阴性对照是理想的空白样本,而不是大家常认为的No Template Control(NTC)。                           

Figure 1.LOB, LOD和LOQ的决定示意图[1]

       文章中一般无需报告LOB,但需要提供NTC及阴性对照的Cq值,尤其是染料法实验,这是因为染料法的特异性比探针法稍差一些。理想情况下,NTC的扩增曲线应是平直的或略有上扬,Cq值是“N/A”或者>40。如果NTC有典型的扩增曲线,或者Cq小于38,说明有较严重的污染,需要对污染原因一一排除,如操作失误、实验室气溶胶污染等。

LOD

       Limit of Detection,即LOD,是以特定的概率(1-β)能够稳定检出的靶标最小浓度(Fig 1)。β是大家所熟悉的假阴性率,一般选择5%,因此LOD常写作“LOD0.05”或者“LOD95%”。LOD需要重复测量低浓度样本,采用参数检验或者ProbitAnalysis等方法来确定。LOD最小是3 copy/aliquot,这是由遵从泊松分布的取样误差导致的,任何检测手段的LOD都不可能做到比这个值更低。

       LOD对于qPCR的定性检测至关重要,因此应报告LOD的确立方式及过程,并备注在LOD浓度时Cq值的SD或者CV。我的建议是,最好采用Probit Analysis等非参方法,并且报告Cq值的SD。Cq值到浓度本身需要经过换算,而且低浓度下标准公式未必适用,而LOD的单位是浓度,而非Cq值本身,因此采用参数方法——LOD=LOB+1.645 * SDCq并不恰当。其次,CV也并不适合衡量本身就无量纲的Cq值。

LOQ

       Limit of Quantification, 即LOQ, 是在一定的准确度或者精确度要求下所能定量的靶标的最低浓度(Fig 1)。通俗的讲,以打靶为例,准确度就是落点离靶心的距离,精确度就是所有落点的分散程度。这两个指标的设定并无限制,随着实验目的的不同而变化。LOQ需要测量一系列低浓度样本,浓度一般在2-10倍的LOD之间,并采用回归分析加以确定。

       尽管MIQE没有对LOQ做出要求,但由于其对qPCR定量检测(如病毒丰度定量等)的重要性,我建议在定量实验中要报告LOQ的指标及确定方式,以便提高读者对文章中定量数据的信心。

线性范围

       线性范围,顾名思义,在整个范围内的信号输出都与浓度变化成线性关系(正负相关都有可能)。几乎所有qPCR设备都有一个必备参数,都号称超过9 log的动态范围,这与线性范围是完全不同的两个概念,不能混淆(Fig 2)。常规做法是通过标准曲线加以衡量,一般要求R2>0.98即可。但更严谨的方法是要采用多项式回归的方法,并经过检验来确定高次项(>1)的系数均为0。

Figure 2. 动态范围与线性范围的区别

       标准曲线的做法之前跟大家分享过,比如如何设立梯度,做多少重复等,在此不再赘述。文章中要报告标曲方程的截距、斜率及计算出来的扩增效率E,还有拟合系数R2。进一步地,能给出扩增效率E和整个线性范围的置信区间CI更佳。CI线的线性回归图可以通过Origin、Graphpad及SPSS等专业统计绘图软件来绘制(Fig 3)。

Figure 3. Origin绘制的带置信区间的标准曲线

 

      下一期将继续介绍qPCR validation的部分,会将重点放在多重qPCR实验上。

 

参考文献

1.  Granger, Jennifer H.,et al. “Prospects for point-of-care pathogen diagnostics usingsurface-enhanced Raman scattering (SERS).” Chemical Society Reviews 45.14(2016): 3865-3882.

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