玩转qPCR系列:多重qPCR及Tm优化

       上一期介绍了qPCR的评价指标,当然这些指标并不局限于qPCR,所有的定量分析技术都会用得到。本期介绍多重qPCR中如何验证性能及Tm的优化。

 

多重qPCR

       很多qPCR实验都会用到多重反应,最典型的就是基因表达和SNP分析[1]基因表达通常两重,一个靶标一个内参;SNP则可能多达四重反应,这与突变类型的种类相关。事实上,多重qPCR并不局限于常规的多色实验,还可以通过杂交产物的Tm来进行多重分析[2],后面在介绍溶解曲线应用时会提及,本期仍然聚焦在常规的多重实验。

       一般地,几重qPCR反应就意味着需要几对不同的引物和几条不同标记的探针,荧光标记与仪器的检测通道一一对应(Fig. 1)。实验设计时第一个关键问题就是引物探针的设计。因为多重反应都在同一个管里进行,使用同一个扩增程序,这就需要所有反应的最佳Tm相差很小,因此提高了引物和探针的设计要求。

Figure 1. 不同的检测通道对应不同的荧光标记.图片来
自于Bio-Rad官网.

        第二个难题是确认几个反应是否有相互的影响和干扰,也是最容易出现的问题。这种影响可以从特异性和扩增效率两方面进行评估。首先,探针的特异性必须很好,尤其是SNP实验,只有一个碱基之差很容易导致错配。假设是一个四重反应,可以通过引物对A及探针B、C和D的组合来判断是否有错配发生。其次,扩增效率不能发生很大的变动,可以通过单重及多重的标准曲线加以评估。一般而言,由于多重反应对原材料的消耗较快,因此会对扩增曲线的平台期有较大的影响,但很少会影响指数期。

Figure 2. 多重反应对FAM通道的扩增效率几乎没有影响。
据来自于Bio-Rad。

      可能大家会有一个疑问,即便多重反应较大程度的降低了某个通道的扩增效率,比如从98%降到了70%,但其标曲的R2值很接近1,比如0.99,这种情况是否可以接受?首先要检查梯度范围是否够宽,如果足以覆盖所有的待测样本,且拟合度很高,那么这种情况就是可以接受的。事实上,较低的扩增效率往往伴随着拟合度的下降,在很大的浓度范围内,抑制程度一般不会一直维持在某个水平。

       多重反应中,要报告每个反应的扩增效率及LOD水平(参考上期的内容),因此标准曲线是必须要做的。同时,要特别注意,如果丰度极低的靶标和较高的靶标同时检测,很可能会导致低丰度靶标的漏检,尤其是当其扩增效率不高时。

Tm值优化

       这个方面之前提及过,在此仍然要强调,扩增效率的提高可以提升LOD水平,减少非特异性产物的产生,标准曲线的重复性及可信度也会提高;而Tm值优化是提高扩增效率最直接最简单的方法,只需要一台具有温度梯度功能的仪器,时间上可能还用不了半天。即便是这样,很多实验者仍然对其忽视。在此建议,将Tm优化纳入到预实验环节中,通过qPCR或者PCR+电泳的方法确认最佳的Tm值(Fig. 3),并加以报告。

       这里提醒大家,软件预测的引物和探针的Tm值仅用于参考,而且最佳Tm随着反应环境的变化而变化,预测的准确度并没有预期的那么高,因此不能盲目迷信,最佳的Tm仍然要通过实验证据来确认。

Figure 3. 不同的Tm值导致不同的扩增效率。数据

来自于Bio-Rad。

特异性

       之前也讲过特异性分析,但局限于前期设计预测,预实验时也要进行特异性分析的工作。区分是否是特异性的产物有很多方法,如电泳、测序、酶切验证及溶解曲线等,各有利弊。电泳比较简单,但只能分析片段大小;测序最权威,但耗时耗成本;酶切得找到合适的位点,且不利于分析太短的片段;更推荐的是溶解曲线,可以从片段长短及碱基组成两方面进行分析,且简单快速(Fig. 4)。

Figure 4. Tm值分别在57℃(左图)及61℃(右图)时对应的
溶解曲线。数据来自于Bio-Rad。

       无论采用何种方法,都要报告分析结果,以便读者对实验的特异性有所把握。

 

       下一期我们进入MIQE的最后一部分,也是比较难的部分——数据分析。

 

参考文献

1. Elenitoba-JohnsonKS, Bohling SD, Wittwer CT, King TC. Multiplex PCR by multicolor fluorimetry andfluorescence melting curve analysis. Nat Med 2001;7:249 –53.

2.   Wittwer CT, Herrmann MG, Gundry CN, Elenitoba-Johnson KS. Real-time multiplex PCR assays.Methods 2001;25:430–42.

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