qPCR标准操作要求解读—-The MIQE Guidelines

qPCR标准操作要求解读-The MIQE Guidelines

:qPCR除常规我们认为的反应体系混合及程序上机运行之外,还包含多个需要注意的操作细节,稍不留意就会拿到奇怪的实验结果或根本拿不到数据结果。在上篇文章中提到,在进行Western Blot实验时,越来越多的研究表明看家蛋白 (β-actin,β-tubulin和GAPDH ) 表达会发生变化,或者受实验加药及各种处理影响。追述上游,基因层面同样面临此类问题,细思极恐。另一方面,qPCR实验在最后的数据计算及统计学分析上,不同作者因对数学的理解不同,导致相同的结果,不同的人进行分析,得出的结论也往往不尽相同。本文就qPCR实验操作时的一些基本原则,参考MIQE Guidelines进行整理,今后也会针对内参的选择和统计学数据计算推出相关的专题。
强迫症晚期的我既想尊重原著给你全文,又想尽可能直白不绕弯子,考虑再三,以注释的方式用其他颜色标注在我认为解释仍旧模糊的地方,供你参考。

关键字MIQEqPCR Guidelines,

    MIQE Guidelines发布于2009年的Clinical Chemistry期刊,当年IF6.891。它以结果的可靠性为目标,有助于确保科学文献的完整性,促进实验室之间的一致性,并提高实验透明度。MIQE是一套指导方针,罗列了发表qPCR实验数据相关文献时所需包含的最少信息,同时包含一份检查表,用于读者将手稿首次提交给期刊前进行自检。通过提供所有相关的实验条件和分析特征,评审人员可以评估所用方案的有效性。所有试剂、序列和分析方法的完整提供是必要的,以使其他研究人员能够重现结果。MIQE Details应以缩写形式发布或作为在线补充。遵循这些指南将帮助更好的实验实践,允许对qPCR结果进行更可靠和明确的解释。

           ——2009美国临床化学协会

     

     包含qPCR实验数据的大量文献中,往往使用不同的试剂、操作流程、分析方法和报告格式,有时候,每位作者会针对自身认知建立自己的评估标准。这个现象说明大家对如何更好地进行qPCR实验显著缺乏共识,会导致一系列严重的缺陷长期存在,如同一个人无法重复自己的实验(重复性);不同课题组无法重现别人课题组的实验结果(重现性)。阻碍qPCR作为独立技术标准的地位。
影响qPCR最终数据分析的技术缺陷包括:
(a)样品储存、制备和核酸质量不好,产生高度可变的结果;
(b)反转录引物、qPCR引物和探针选择及预实验条件摸索不当,导致实验反应效率低且实验结果不稳定;
(c)不合适的数据和统计学分析,产生的结果或具有高度误导性。
因此,存在着“科学文献被腐蚀”的危险,大量期刊报告了不充分和相互矛盾的结果。发表和撤稿的一份Science报告“2005年突破”提供了一个令人不安的警告。由于许多期刊中发表的使用qPCR技术的研究报告中,大多数没有提供足够的实验细节,使读者根本不能够批判性地评估所呈现结果的质量或进行重复实验。这个问题因缺乏信息而严重恶化。(注:我手机里关注的几个公众账号中,几乎每周都有发布撤稿的文章,其中以Western Blot数据造假为主。提示读者注意。
具体来说,关于样本获取和处理、RNA质量和完整性、反转录细节、PCR效率和分析参数的信息经常被忽略,而样本上样量校正通常是通过单个参考基因进行的,也没有充分的理由说明为什么选择这个基因。
MIQE的目的是为表1中列出的作者、评审员和编辑提供最低限度的信息规范,这些信息必须提供在qPCR实验中报告,以确保其相关性、准确性、正确解释和可重复性。它参考用于DNA微阵列分析,蛋白质组学实验,基因组序列规范, RNA干扰和代谢组学等的指导方针建立。所有这些都是MIBBI(生物和生物医学调查的最低信息,http://www.MIBBI.org)协调的倡议。不建议强制列入一种共同报告模式以允许数据共享,尽管预计今后对这些准则的更新可能包括这样一项建议。相反,这些指南的目标是结果的可靠性,以帮助确保科学文献的完整性,促进实验室之间的一致性,并提高实验透明度。应结合最近深入讨论qPCR标准化问题的出版物阅读。

命名法

     一些术语需要标准化以确保澄清:
1.建议将缩写qPCR用于real-timePCR,并将RT-qPCR用于逆转录-qPCR。将RT-PCR简称为qPCR引起混淆。
2.用于做上样量校正的基因应作为参考基因,而不是传统认为的看家基因直接作为参考基因(看家基因是会变化的,这点如同看家蛋白一样)。
3.TaqMan探针应称为水解探针。
4.FRET探针(荧光共振能量转移探针)是指发射/猝灭依赖于两个荧光染料分子的电子激发态之间相互作用的一般机制。LightCycler型探针应称为双杂交探针。
5.《牛津英语词典》只列出quantification,无quantitation;因此,前者是恰当的词。
6.描述用于量化的术语,PCR循环的术语与文献中当前使用的threshold cycle(Ct), crossing point(Cp)和andtake-off point(TOP)不一致。以上这些术语均指qPCR仪器的相同值,由qPCR仪器的竞争制造商出于产品差异化的原因而创造,而不具有科学的准确性或清晰度。根据RDML(Real-Time PCR Data Markup Language)数据标准( http://www .RDML.o rg),我们建议使用quantification cycle( Cq)。

 

概念上的考虑

     为了解释和证明这些指导原则,我们发现回顾围绕qPCR实验的一些关键问题是有用的:
1. 分析灵敏度是指一个样本中可通过实验精确测量的最小拷贝数,而临床灵敏度是指在特定疾病患者们中,被检测确定为阳性的百分比。灵敏度为limit of detection(LOD),即在给定的分析程序中,可以确定且合理(通常使用95%的概率)检测得到的浓度。理论上最灵敏的LOD可能为3copies /PCR,假设为泊松分布,95%的几率在PCR中包含至少1个copy,并且是单拷贝检测。
实验程序通常包括样品处理步骤(即提取)和必要时的反转录。如果考虑到体积变化和这些步骤的效率,理论上最灵敏的LOD可以用与实验相关的单位表示,例如copies/ng组织。
实验结果不应低于理论上可能的LOD。由此也可以看出,“0”的结果是毫无意义和误导性的。qPCR分析中的LOD评估由于Cq的对数性质而变得复杂,因为当模板浓度为零时Cq是未定义的。qPCR中LOD的适当定义及建模是后续研究的重点。
2. 分析特异性指的是qPCR实验检测目的靶序列,而不是同时检测在样本中也存在的其他非特异性靶点。诊断特异性是指没有特定条件的个体们的百分比,检测结果表明该条件为阴性。
3.准确度是指实验测量的浓度与实际浓度之间的差异,以倍数变化或拷贝数估算。
4.重复性(短期精密度或批内方差)是指同一批样品在同样的实验方法下重复分析后的数据精确度和稳定性。它可以表示为Cq方差的SD。另外,拷贝数或浓度变化时可以使用SD或CV。然而,CVs不应与Cqs一起使用。
5.重现性(长期精密度或测量间方差)是指runs之间或不同实验室之间结果的变化,通常表示为拷贝数或浓度的SD或CV。不同runs生成的Cq值受到固有的运行间变化的影响;因此,报告运行间 Cq变化是不合适的。
描述靶基因mRNA浓度的文章应该明确说明靶基因是指什么。大多数人类基因和其他多细胞生物中的许多基因的转录本是交替剪接的,这些剪接变体限定了可供选择的蛋白质亚型,剪接模式的变化在不同组织或不同发育阶段都有文献报导。因此,基于单外显子的RT-qPCR分析可能检测到许多剪接变异体,而跨内含子引物可能更具专一性,但也不排除漏掉一些剪接变异体。常染色体上显示等位基因表达不平衡的非印记基因也被报导(2008年)。综上所述,这些发现意味着单纯以一个或至多两个mRNA外显子为靶点的RT-qPCR分析不再足以描述特定基因的表达水平。因此,引物的序列信息必须与已知剪接变异体和单核苷酸多态性数据库中记录的单核苷酸多态性位置的特异性评估一起提供。对于从RTprimerDB数据库中选择的primer集,可以通过查阅包含所有相关信息的RTprimerDB网站(http://www.RTprimerDB .org)轻松完成。对于商业分析,需要批次(lot)信息和供应商的实验验证标准。强烈反对那些仅在计算机上证实可行的非验证性商业试剂及实验的报告结果。
必须牢记,检测一个mRNA的存在与否并不能提供该mRNA是否会被翻译成蛋白质的信息,或者,实际上,一个功能性蛋白质是否被翻译的信息。免疫组化、Western Blot或其他蛋白研究方法并不总能与细胞mRNA定量数据一致,且很多文献证实两个层次的方法在检测时数据经常缺乏一致性,这对于mRNA来说尤其如此,mRNA指定的蛋白是多功能蛋白复合物的一部分。
还需要注意的是,大多数来自RT-qPCR的RNA数据不是绝对定量,而是相对定量。因此,用于做上样量校正的参考基因的选择是至关重要的,对RT-qPCR实验有效性的任何评估也必须证明相对定量参考的适当性。因此,开发通用的参考DNA和RNA校准物,虽然很有帮助但不会是万能的。
RT-qPCR实验结果的数据差异不仅仅是由于实验操作的变化,也是由于不同作者使用不同的数据算法造成的,每种算法的作者都对数据做出自己的假设。因此,尽管qPCR经常被宣称金标准,但实际上这个“标准”是一个可变的标准,报告实验结果需要相当仔细的分析和解释。

研究 vs 诊断应用

     qPCR技术的应用可大致分为研究应用和诊断应用。研究应用通常分析广泛的目标基因,相对来说通量较低,并且包含很多不同的样本类型。需要处理的主要参数与实验的灵敏度和特异性相关,即该组实验可检测多少copies的靶基因,并且无模板对照(NTCs)呈阴性。
相比之下,诊断应用通常分析较少的目的基因,但需要针对少数样本类型进行高通量实验。尽管所有适用于研究应用的考虑因素也适用于诊断分析,但临床诊断分析有一些附加要求需要考虑。这些要求包括:有关分析灵敏度和特异性的信息,即当目的基因检出后,检测结果返回阳性的频率;以及未检测出目的基因时,阴性结果持续多久。此外,实验室内部和实验室之间的准确度( accur-acy)和精度(precision)通常由外部QC进行。其他临床实验室要求包括:生成可报告结果的标准、是否对样品进行重复测量、关于假阳性/假阴性数据分辨率的数据以及使用相同和不同技术的多个实验室结果的相似性。到目前为止进行的实验室间比较,都强调了qPCR诊断分析标准化的必要性。

 

样品采集、处理和制备

      样本采集是实验结果不确定性的第一个潜在来源,特别是针对RNA的实验来说,因为样本采集和处理方法很容易使其降解。有学者认为新鲜组织可以在冰上保存而不会对RNA的质量和浓度产生重大影响,尽管这一假设对某些mRNA和组织可能可行但并不普遍适用,必须慎用。因此,详细写明组织样本的获取地点以及是否立即处理非常关键,如果样品未立即处理,则有必要写明样品是如何保存的以及保存的时间和条件。对样品的简要描述也是必不可少的。例如,对肿瘤的显微镜检查应写明采集的肿瘤占比整体百分之几,这些信息应该报告。
核酸提取是第二个关键步骤。提取效率取决于充分均匀化、样品类型(如原位组织,对数期培养细胞)、目标密度、生理状态(如健康、癌变或坏死)、遗传复杂性和处理的生物量。因此,有必要提供核酸提取方法的细节,并描述用于测量核酸浓度和评估其质量的方法。这些细节对于从新鲜冷冻激光显微解剖活检样品中提取的RNA尤其重要,因为组织样品制备流程的变化对RNA的产量和质量都有重大影响。

 

核酸质量控制

1. RNA样本
     提取样品中RNA的定量是很重要的,因为在比较不同样品时,建议使用大致相同数量的RNA。有几种常用的量化程序,包括分光光度法、微流控分析、毛细管凝胶电泳或荧光染料检测等。这些方法产生不同的结果,因此试图比较不同方法获得的数据是不可行的,建议仅用单一方法测量所有样品并报告此信息。
     测试和报告基因组DNA污染的程度以及记录可容忍的此类污染量的临界阈值标准也很重要。
必须报告RNA样本是否已用DNase处理(包括所用DNase的类型和反应条件),并报告每个核酸靶点的Cq值与阳性和NRT(no-reverse transcription controls)的结果。必须记录RNA模板的质量评估。除非提取的总RNA量太低,无法进行质量评估。这种情况是指从单个细胞、血浆、其他无细胞体液、一些激光捕获的样品或澄清的组织培养基中提取的RNA,以及提取和RT-qPCR步骤作为连续的单管实验时。要报告的关键信息包括RNA质量、完整性和缺少逆转录或PCR抑制剂的数据。值得记住的是,由于mRNAs对环境刺激的自然调节,RNA在体内明显降解。这种RNA降解的来源是研究人员无法控制的;它的一个表现就是即使是高质量的RNA样本也能显示个别mRNA的差异降解。
     
A260/A280比值必须在中性pH的缓冲液中测量,但如果要将核酸用于定量分析,这种测量是不够的,特别是当目的是测量细胞mRNA浓度的微小差异(<10倍)时。吸光度比值确实提供了RNA纯度的指标,因为DNA或残留苯酚的存在会改变比率。但至少应该提供凝胶电泳证据,或者更好的是,基于微流控的rRNA分析或参考基因/靶基因3’:5’完整性分析的结果。
     
如果显示RNA样品部分降解,则必须报告此信息,因为检测低水平转录物的分析灵敏度可能降低,并且转录物降解的相对差异可能产生不正确的靶比。办法①利用分光光度计进行浓度计算②琼脂糖电泳确认完整性
2.DNA样本
    一般来说,DNA的降解问题要小得多;但是,在法医应用中评估DNA降解的程度是很重要的,也就是说,在某些情况下,包括失踪人员案件在内的恶劣环境条件可能已经降解了DNA的化学结构。小扩增子的qPCR试剂有助于减少分析相关的问题。DNA质量的定量测量,参考RNA的方法。
    抑制剂的影响更普遍,必须在文章中加以说明,重要的是确保与DNA共纯化的抑制剂不会影响结果,例如病原体检测及其定量。方法一是用阳性对照品来检测抑制作用,但是不同的PCR反应受到核酸提取物中结合物质的抑制作用可能不同。因此,通常使用方法二,即核酸稀释来证明观察到的Cq值或拷贝数的减少与预期结果一致,并报告这些数据。办法①利用分光光度计进行浓度计算②琼脂糖电泳确认完整性

反转录

     反转录步骤将实质性变化引入RT-qPCR实验。因此,有必要详细描述将RNA转化为cDNA的流程和试剂。此文档必须包括反向转录的RNA质量、引物策略、酶的类型、体积、温度和反转录步骤的持续时间。建议反向转移步骤一式两份或三份,并且每个样品中的总RNA浓度相同。应通过稀释样品(最好)或使用诸如SPUD的通用抑制试剂来检测反转录效率或PCR的抑制办法①梯度稀释样本以检测反转录效率是否每次实验都保持一致。

qPCR

必须为qPCR分析提供以下信息:每个靶基因和内参基因的database accession numbers、每个引物和任何探针的外显子位置、每个寡核苷酸的序列和浓度,包括所有染料和/或修饰碱基的身份、位置和连接(identities, positions, and linkages)。还需要聚合酶的浓度和特性、每个反应中模板(DNA或cDNA)的质量、Mg2+的浓度、缓冲液的确切化学成分(盐、pH、添加剂)和反应体积。研究人员还必须记录他们使用的仪器型号,并记录所有PCR反应条件。由于所用耗材也影响热循环反应,因此有必要确定单管、八连管或96孔板及其制造商。所用塑料制品(例如白色或透明)的透明度也很重要,因为不同的塑料在荧光反射和灵敏度方面表现出很大的差异。当使用96孔板时,密封方法(热粘合与粘合剂)会影响板材周边样品的蒸发,因此应记录在案。

由于PCR效率高度依赖于所用的引物,因此必须公布它们的序列。有需要可向供应商索取。另,强烈鼓励向公共数据库(如RTprimerDB)提交信息;方便信息共享。

1.引物的设计

1.1 二级结构

核酸的结构(如茎环二级RNA结构)对逆转录和PCR的效率有着重要的影响。因此,引物、探针和PCR扩增的位置必须考虑到 RNA 模板的折叠。序列应使用nucleic acid–folding 软件检查,例如mfoldforDNA(http://mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/dna-form1.cgi)或RNA (http://frontend.bioinfo.rpi.edu/ applications/mfold/cgi-bin/RNA-form1-2.3.cgi)等。理想情况下,折叠结构应该提供给编辑。

1.2 特异性

   在电子工具中,如BLAST或equivalentspecificity searches对于实验设计是有用的。任何与假基因或其他非预期靶点的可观察同源性都应记录,并作为校准序列提供以供编辑审查;然而,特异性必须通过直接的证据(如电泳凝胶、溶解曲线、DNA测序、扩增子大小和/或限制性内切酶消化)进行实验验证。

预测寡核苷酸溶解曲线(Tm)的算法对于初始设计是有用的,但实际的最佳退火温度必须通过实验确定。虽然引物优化已经变得不再流行,但很明显退火优化不良对分析质量有很大影响。引物二聚体的显著存在在探针法实验中产生较低的PCR效率,并且可能在基于SYBR Green的分析中产生假阳性。一些引物优化的证据应提供给编审,理想的形式是退火温度梯度或Mg2+浓度梯度摸索并以Cq值、荧光与循环曲线图的形式呈现数量和/或溶解曲线。(实验①考察引物合成公司是否在引物设计时考虑到二级结构、跨内含子设计、测序验证等,尽可能选购考虑全面的引物进行实验。②进行引物的温度梯度优化预实验。

3.质控及定量标准

除了上文提到的RT-qPCR分析中的NRT外,所有qPCR反应都需要额外的质控和/或定量校准品。探针法时使用NTC检测PCR污染,还可以在SYBR-Green反应中将非预期的扩增产物(例如,引物二聚体)与预期的PCR产物区分开来。每96孔板或每批样品上应包括NTC,并应确定数据拒绝的条件。例如,如果未知最低浓度的Cq为35,则可以忽略具有Cq值≥40的NTCs。

从实验样品中选取的目的基因作为阳性对照,监测实验随时间而产生的变化,尤其在每次无标准曲线时的实验中是相当必要的。

定量校准品可以是纯化的靶分子,例如合成RNA或DNA寡核苷酸,跨越完整的PCR扩增子、质粒DNA结构、克隆到质粒中的cDNA、体外转录的RNA、内参RNA池、特定生物样品中的RNA或DNA,或国际公认的生物标准。稀释应进行到规定浓度的载体tRNA(酵母或大肠杆菌在10-100 ng/L)。对于人类病原体的检测,校准品可以稀释成阴性对照样品RNA或DNA,也可以稀释成健康人血浆,然后在载体存在时进行裂解。特定模板的连续稀释液可以作为储备溶液制备,以抵抗多次冻融循环。当检测到Cq偏移为0.5–1.0时,应准备新批次。或者,校准曲线的溶液可以在4℃下保存一周,然后丢弃。

对于诊断分析,qPCR应包括一个独立验证的校准器(如果可用),该校准器位于分析的线性间隔内。也推荐阳性和阴性提取对照。办法①实验需要设立技术学重复及生物学重复,空白对照NTC/NRT,有必要时设立阴性阳性样本对照

4.分析性能

必须确定以下分析性能特征:PCR效率、线性动态范围、LOD和精密度。

4.1 PCR效率。稳定和精确的qPCR检测通常与高PCR效率相关。当检测经内参基因校准的目的基因mRNA浓度时,PCR效率尤其重要。△△Cq法是测定样品间不同浓度的最常用方法之一,是基于单个内参基因的校准。计算目标基因和内参基因的Cq值的差异(△Cq),并直接比较不同样本的△Cq。这两个基因必须以可比的效率进行扩增,以便进行比较。然而,最普遍的方法并不一定是最合适的,而且,已经研究了更广泛的定量模型来校正扩增效率的差异,并允许使用多个内参基因进行计算。

PCR扩增效率必须通过标准曲线来确定,因为这种校准提供了一种简单、快速和可重复的平均PCR效率、分析灵敏度和检测稳定性的指示。扩增效率应根据标准曲线对数线性部分的斜率确定。具体地说,当初始模板浓度(自变量)的对数绘制在x轴上并且Cq(因变量)绘制在y轴上时,PCR效率=10-1/斜率-1。理论上最大值为1.00(或100%)表明,产品的数量每循环翻一番。理想情况下,评估PCR效率的方法的CIs或SEs是从重复的标准曲线中报告的。

每个定量目的基因的标准曲线必须包含在提交的手稿中,以便可以将此信息提供给审稿人;从这些标准曲线导出的斜率和y轴截距必须包含在出版物中。PCR效率的差异会产生不同斜率的标准曲线。因此,随着模板量的变化,目标和参考之间的Cq值之间的差异不会保持恒定,并且相对浓度的计算将不准确,产生误导性结果。

Cq>40的结果是可疑的,因低扩增效率,往往不应报告;然而,使用这种任意Cq cutoff值是不理想的,因为它们可能太低(消除有效结果)或太高(增加假阳性结果)。办法①每次实验每个基因进行标准曲线实验,获得扩增效率。参考R2值

4.2 线性动态范围。必须描述反应线性的动态范围(通过标准曲线确定的最高到最低可量化拷贝数)。根据用于生成标准曲线的模板,动态范围应至少覆盖3个数量级,理想情况下应扩展到5或6log10浓度。标准曲线的线性区间必须包括被定量的目标基因的区间。由于定量下限通常定义不明确,应确定声明在线性区间内的最低浓度的变化。必须报告相关系数(r2值),理想情况下,应在整个线性动态范围内提供CIs。办法①每次实验每个基因进行标准曲线实验,获得间隔均匀的5-8个梯度值点。

4.3 LOD。LOD被定义为可以检测到95%的阳性样品的最低浓度。换句话说,在一组含有目的基因的重复中,在LOD浓度下,不应发生超过5%的失败反应。低拷贝PCR是随机限制的,每个PCR 有3个拷贝的LOD是不可能的。然而,如果进行多次实验反应,则可通过数字PCR的方式获得较低浓度的准确定量。实际上,可以通过有限稀释法来检测浓度校准,以遵循泊松分布的情况下表明失败和成功实验反应的百分比。

4.4 精度(Precision)。qPCR结果的变化有多种解释,包括影响退火和/或变性完成的温度差异、移液误差引起的浓度差异和随机变化。qPCR中的精度通常随浓度而变化,随拷贝数而降低。理想情况下,分析内变化(重复性)应以SD error bar或具有重复样品的标准曲线上的CIs的形式显示在图中。CVs不应与Cqs一起使用,但可用于表示拷贝数或浓度的差异。这种技术学变异应与生物学变异相区别。生物学重复可以直接解决组间或治疗组间qPCR结果差异的统计学意义。对于诊断性分析,可能还需要报告不同地点和不同操作人员之间的测量精度(重现性)。验证办法①每个基因每对引物进行一次温度梯度预实验,观察哪组实验后的结果扩增曲线与溶解曲线同时较好,选择该温度进行正式实验。

5 多重qPCR

多重实验大大扩展了qPCR分析的能力,特别是当需要同时检测点突变或者多态性时。多重实验需要提供证据,证明在一根试管中对多个目标的准确定量没有受到破坏,即,扩增效率和LOD与进行单重实验时相同。当丰度较低的目的基因与丰度高的目的基因共同实验时,这一问题尤为重要。办法①原则上先优化单重实验,后进行多重混合。

数据分析

数据分析包括对原始数据的检查、对其质量和可靠性的评估,以及生成可报告的结果。很多文献已经描述了各种数据收集和处理策略,一项系统评估指出qPCR数据分析方法不同而在分析能力上有很大的不同。

关于数据分析和置信度估计方法的详细信息以及所用软件的说明是必要的。必须指定识别异常值的方法和此类数据的处理。记录分析精度需要确定用于评估差异的统计方法(如,95% CIs)以及相应浓度或Cq值的表示。如果可能,此类信息应包括重复性和重现性数据。如上所述,报告Cqs的CVs是不合适的,因为Cqs总是低于为拷贝数计算的CVs(因此可能具有误导性)。必须提供用于评估准确性的方法的信息,包括报告组间差异显著性的统计。

8.1 均一化

均一化是进行可靠qPCR分析的一个重要组成部分,因为这一过程控制抽提产率、反转录效率和扩增效率的变化,从而能够比较不同样本的mRNA浓度。使用内参基因作为内部control是规范细胞mRNA数据的最常见方法;但尽管内参基因通常被认为是最合适的校正策略,但它们用于特定的组织或细胞类型和特定的实验设计时,必须通过实验验证是否实用。不幸的是,尽管人们越来越多认识到系统验证的重要性,尽管使用不合适的内参基因进行校正的潜在误导性影响广泛,这些考虑仍然被广泛忽视。因此,许多分子分析仍然包含均一化程度很低的qPCR数据。

均一化包括报告目的基因与内参基因的mRNA浓度之比。内参基因mRNAs应稳定表达,其丰度应与样品中mRNA总量呈强相关。

除非作者为审稿人提供明确证据证实内参基因在所述实验条件下的不变表达,否则不接受针对单个内参基因的均一化。内参基因的最佳数目和选择必须通过文章具体实验确定并报告方法。办法①进行多个内参筛选,必须选择表达量恒定的内参进行上样量均一化校正。

8.2 易变性

生物系统的固有变异性可能与组间的实验差异相匹敌,甚至超越后者。当使用许多生物学重复来提高实验的统计学重要性时,这种变化经常被发现。尽管生物学重复之间的差异可能很大,但足够的数量使我们能够分辨出较小的实验差异。已有文献提供了一个处理此类数据的教科书示例,以及如何从受高度生物变异影响的分析中挽救具有生物学意义的数据。许多因素会导致实验变异,并影响达到给定统计能力所需的生物重复数。因此,能力分析有助于确定有效结论所需的样本数。

8.3 定性分析

利用PCR技术仅仅检测核酸模板的存在,而不是对其进行准确定量,被称为定性PCR,广泛应用于病原体诊断。PCR方法的定性/定量分层问题在于,准确回答是/否,需要有关PCR分析的low-end灵敏度的信息。因此,即使是定性分析也应提供有关分析能力的相关信息,特别是关于第7.4.2节和7.4.3中讨论的要点。

公式的选择:这个公式方法学文献中描述,必须保证目的基因及内参基因的扩增效率同时为100%(或者95-105%之间)才能使用。否则需要首先优化扩增效率或者带入实际的扩增效率进行计算。此部分会再开新文章介绍。

结论

目前已经充分认识到确保qPCR和RT-qPCR分析质量的那些保证措施的必要性。qPCR与普通PCR方法的主要区别在于前者在准确定量目的基因方面的潜力。必须清楚这种差异,而且不能假定传统PCR结果可以直接转换为qPCR结果。表1为编写qPCR研究报告的作者提供了检查表。认为必要的条目(E,essential)认为期望的条目(D,desirable要求允许审稿人评估工作,并允许其他调查人员复制工作。当然,运用常识很重要:符合检查表上的所有项目,不需要针对数百个目的基因的表达签名进行初步筛选。

总之,本指南的目的是3重

1.使作者能够设计和报告具有更大内在价值的qPCR实验。

2.给予审稿人和编辑既定标准以衡量提交稿件的技术质量。

3.遵循这些准则,可以更容易地重复已发表的研究中所描述的实验。

图片引自The MIQE Guidelines Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments。

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