PCR异常曲线扩增原因总结

异常曲线扩增主要可以归结为以下 6 种
(1)扩增曲线不光滑

主要有两个原因:

     一、扩增信号太弱,经系统矫正后,就会产生不平滑的线,可以通过提高模板浓度重复实验
     二、仪器本身的问题,可能在扩增过程中仪器出现波动或者检测孔本身出现异常。

(2)扩增曲线断裂或下滑

     如图所示是比较典型的曲线下滑,主要原因是模板浓度太高,在基线期内就起峰,仪器会默认起峰的线条仍为基线部分,将扩增曲线往基线位置下拉造成的,可以减小基线终点(例如基线期默认 3-15 个循环,改为 3-10 个循环),重新分析数据,一般都能得到一个比较好的结果。

(3)个别扩增曲线骤降

     这是比较常见的一个问题,反应管内若留有气泡,温度升高后会导致气泡破裂,使仪器检测到的荧光值突然降低。所以进行扩增反应之前,一定要仔细检查反应管内是否有气泡残留。

(4)扩增曲线呈锯齿状且不连续

     这是典型的 ROX 添加不当导致的异常结果,曲线杂乱。首先可以尝试去掉ROX分析数据,看一下重复性是否 OK(复孔间 STD<0.2),如果还是不行,只能下次实验的时候注意< span=””>千万不要加错 ROX!
(5) CT 值很大

      预变性时间至少 5 min,如果是高 GC 的模板,可以延长预变性时间至 10 min,预变性时间不够,会导致酶活未完全释放,酶活释放不好,那扩增效率肯定就不行啦,所以大家在用 qPCR 试剂的时候,一定要注意分辨热启动酶的封闭手段。

 

(6)反应结束无扩增曲线出现

这个问题的常见原因,主要可以归结为以下 5 种
· 反应循环数不够
一般建议设置循环数为 40。
· 程序中未设置信号采集步骤
两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段;三步法扩增程序应当将信号采集设置在 72 度延伸阶段。
· 引物降解
长时间未使用的引物应先通过 PAGE 电泳检测完整性,以排除引物降解的可能性。
· 模板浓度太低
这个大家减少稀释度重复实验就可以,一般来说,未知浓度的样品先从最高浓度做起。
· 模板降解
无解,请重新制备模板!

溶解曲线形状异常

(1)杂峰在主峰之前,Tm 约为 70-75℃——一般为引物二聚体

这种情况主要有三个解决方法:
· 重新设计引物
· 杂峰为引物二聚体,引物二聚体主要是由于体系内引物与引物纠缠比引物与模板结合更容易导致的,可以尝试提高模板浓度、退火温度或者降低引物浓度来进行改善;
· 另外,当目的基因表达量极低时,染料法容易形成引物二聚体产物影响实验结果,此时,建议使用探针法定量
(2) 杂峰在主峰之后,非引物二聚体

上图这种情况就是非特异性扩增,可能是引物特异性不好引起的,也可能是空气中有气溶胶污染所导致。
可以先增加退火温度再试试看,如果没有改善,那么就需要重新更换引物啦。
为了避免这种麻烦,建议大家在进行 qPCR 实验之前,就对自己的引物做一个特异性验证。另外,每次试验的 NTC(no template control)是一定要做哒!
(3)只有引物二聚体,无目的条带

      如果扩增片段过短(小于 80bp),那么仅通过融解曲线就很难区分引物二聚/目的条带。
另外,也有可能是 qPCR 扩增效率低或者没有扩增,体系里边只有引物纠缠成的二聚体了。
总之,产物长度建议大家还是设置在 100-200 bp,不要太短了。

 

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