载体构建原理

  载体构建(vectorconstruction),为把DNA分子运送到受体细胞中去,必须寻找一种能进入细胞、在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。理想的运载体是质粒(plasmid),在基因工程中,常用人工构建的质粒作为载体。载体构建即是构建含外源DNA的质粒。

载体构建是分子生物学研究常用的手段之一。主要包括已有载体多克隆位点MCS的改造和已有载体启动子、增强子、筛选标记等功能元件的改造。载体构建完成后可利用PCR原理进行测序验证。
人工构建质粒

  人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体,如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr),并含有5种内切酶的单一切点。如果将DNA片段插入EcoRI切点,不会影响两个抗生素基因的表达。但是如果将DNA片段插入到Hind Ⅲ、BamH Ⅰ 或 SalⅠ切点,就会使抗四环素基因失活。这时,含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素,但对四环素敏感。没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素,而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素四环素都敏感。pSC101与pBR322相似,只是没有抗氨苄青霉素基因和PstI切点。质粒运载体的最大插入片段约为10 kb(kb表示为千碱基对)。

选择质粒载体的要素是要了解可用到的载体的特征和预测重组克隆所用于的实验。

所有的质粒载体都有三个共同的特征一个复制子一个选择性标志一个克隆位点。复制子是含有DNA复制起始位点的一段DNA(ori),也包括表达由质粒编码的复制必需的RNA和蛋白质的基因。选择性标志对于质粒在细胞内持续存在时必不可少的。克隆位点是限制性内切酶切割位点,外源性DNA可由此插入质粒内,而且并不影响质粒的复制能力,或为宿主提供选择性表型。

选择性标志:编码抗生素抗性的基因对质粒载体来说是最普遍的细菌选择性标志(如pBR322);主要的抗生素选择基因有:氨苄青霉素,氯霉素,四环素和卡那霉素四种。转化的宿主菌一般都是抗生素敏感型的,获得质粒后,它能在有抗生素的平板上生长,从而达到筛选的要求。另一个显性的选择标志就是对λ噬菌体感染的免疫(也就是λ阻抑物)。有时也会用的一些隐性标志,如leuB-(亮氨酸存在时就不能生长)。

如今的载体都含有一多克隆位点Multiple cloning site, MCS)或多位点接头[包含约20个串联排列的限制性内切核酸酶位点(如pUC19)]这些位点在载体内通常是独一无二的,这样就可以防止插入片段插入不恰当的位置,如载体其他的特征导致破裂的位点。多克隆位点的存在可以确保载体合适大部分的DNA片段,可以针对插入片段提供特定的酶切位点图谱,在质粒重组操作方面具有更大的灵活性。在选择质粒载体时既要考虑在多接头处出现的是何位点,又要考虑到这个位点的顺序,因为必须确保特定的位点存在于多接头里。

载体构建流程:

 

基础实验

PCR异常曲线扩增原因总结

2020-8-14 23:50:38

基础实验

载体构建

2020-8-14 23:50:58

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