载体构建

核酸大楼重建,载体构建

将外源DNA片段(目的基因)装载入载体,实现目的基因在宿主细胞中复制表达的基因工程实验操作!

先拆后建,载体构建原理

依赖于限制性核酸内切酶、DNA连接酶,对目的基因和载体进行切割,利用相同末端互补连接,实现目的基因载入载体。

添砖叠瓦,载体构建流程

建材生产,目的基因序列PCR

建材质检:目的基因序列检测

建材收货:目的基因回收

拆旧建新,酶切连接

“拆迁队入场”内切酶切开目的片段与载体,形成相同接口

“施工队入场”DNA连接酶通过相同接口连接载体与目的片段

“样板推广”:重组载体克隆

“新房验收”:重组载体克隆验证

单克隆菌落PCR检测:初步断定1、4、6、7、10为阳性克隆;

酶切电泳鉴定:2、4、6在载体和目的片段大小位置符合预期为阳性克隆;

要确定目的基因序列完全正确需要测序。

载体构建新主张,保护性重建,无缝克隆:目的基因PCR产物两端分别带15-20个载体序列同源碱基,二者互补配对成环,转化后依靠宿主菌修复酶系统将缺口修复

基础实验

载体构建原理

2020-8-14 23:50:47

基础实验

PCR 问题及提高 PCR 扩增特异性的方法总结(1)

2020-8-14 23:51:07

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