PCR 问题及提高 PCR 扩增特异性的方法总结 (2)

扩增曲线问题

正常的扩增曲线一般呈 S 型,Ct 值最好在 20-30 之间。异常的扩增曲线包括曲线无平台期、曲线呈锯齿状和 Ct 值偏大等现象。

1. Ct 值偏大(如 Ct 值>30)

1)模板量低或基因表达丰度低,建议增加模板量观察 Ct 值能否成相应倍数减少。
2)qPCR 整个反应条件不适宜或引物设计不当导致扩增效率低,建议通过标准曲线确认扩增效率。
3)扩增产物过长,建议用三步法程序扩增或通过优化引物,扩增产物长度最好不超过 300bp。
4)体系中可能存在抑制剂影响酶的活性,建议梯度稀释模板或重新制备纯度更高的模板。
2. 扩增曲线无法达到平台期

基因丰度低、循环数较少,建议增加循环数或选择适合低丰度基因定量的产品。
3.扩增曲线平台期锯齿状

1)RNA 纯度低,建议梯度加大模板稀释倍数看优化效果或重新制备高纯度 RNA 重新实验。
2)仪器长时间未校准,建议定期进行仪器校准保养。
4.有熔解曲线,无扩增曲线
可能是扩增程序设置错误,未进行荧光信号搜集,建议重新实验,增加扩增程序中延伸阶段荧光信号的搜集。
5. 阴性对照有扩增
1)NTC 有扩增,可能有以下两种情况:
①Ct>35,熔解曲线 Tm 值<80℃(一般正常 qPCR 产物,大小在 100-300bp 之间,熔解曲线 Tm大多在 80°C 以上),可能是引物二聚体导致,可进一步优化引物。
②有 Ct 值且<35,表示反应体系被污染,可逐步排除污染源。
2)NRC 有扩增
NTC 正常,NRC 有 Ct 值,可能是 RNA 含有 gDNA 污染。建议用 DNase I 消化或使用含有 gDNA去除的反转录试剂盒。
【注】NTC 是指将 H2O 代替模板的阴性对照反应;NRC 是指将未反转录的 RNA 作为模板的阴性对照反应。
6.复孔重复性差

1)加样误差导致,建议移液器定期校准,另外可通过扩大反应体系或提前配制好预混液优化。
2)模板量低,建议提高模板量,使 Ct 值落在 15-30 之间。
3)仪器长时间未校准,建议定期进行仪器校准保养。
熔 解 曲 线 异 常
熔解曲线常用来判断 qPCR 结果的特异性,理想的熔解曲线为单峰,异常的熔解曲线会出现杂峰、
双峰、宽峰等可能的情况,下面我们来逐一分析。
1.熔解曲线出现双峰
1)双峰,较低峰 Tm 在 80℃之前

可能存在引物二聚体,建议降低引物浓度或重新设计引物等方式优化。
2)双峰,双峰 Tm 在 80℃以后

①引物特异性过差导致非特异性产物扩增,建议 Blast 检查引物特异性或重新设计引物。
②gDNA 污染,可通过 NRC 进行确认。若 NRC 有 Ct 值,可重新制备模板。
2. 熔解曲线单峰但不尖锐

可能存在大小相近的非特异性产物,建议进行高分辨率琼脂糖电泳确认。
3. 熔解曲线单峰但 Tm 值在 80℃以前
推测是未加模板,仅有引物二聚体的扩增。进行高分辨率琼脂糖电泳确认产物或重复实验。
4.有扩增曲线,无熔解曲线
可能是熔解程序设置错误,未搜集荧光信号,建议重新实验,增加熔解曲线阶段的信号搜集。
5.熔解曲线峰型杂乱
1)反应体系污染,结合 NTC 和 NRC 结果确认污染情况,建议从水,引物,酶和环境等逐一排除污染。
2)试剂暴露在强光或高温下导致试剂失效,建议用新的试剂做对比实验。
3)仪器长时间未校准,建议定期进行仪器校准保养。
4)耗材与仪器不匹配,需确认对应仪器对耗材的要求。
6.两种试剂对比,得到的 Tm 值不一样
可能是试剂的促解链成分或含量不一样,导致解链温度不一样。

 

基础实验

PCR 问题及提高 PCR 扩增特异性的方法总结(1)

2020-8-14 23:51:07

基础实验

PCR常见问题分析

2020-8-14 23:51:39

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