细胞增殖:MTT实验

一、实验原理

MTT是一种检测细胞存活和生长的方法。实验原理为:活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的甲瓒,用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值),来判断活细胞数量。OD值越大,细胞活性越强(如果是测药物毒性,则表示药物毒性越小)。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。

缺点:由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水,需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加,也会对实验结果的准确性产生影响,而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。

(注:MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力,但不能测定细胞绝对数。)

二、MTT配制方法通常MTT配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS做溶剂。(市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g,对于100mg的包装,一次性将其全配制成溶液,如100mg用20m1PBS来溶解。)
具体做法:预先在50ml离心管加入20m1 PBS,从中先吸取500-1000u1 PBS装入含MTT的小管中,吹打数十次后将其移入50ml离心管,然后再混匀。可以重复几次以使小管中的MTT不残留于管内。将MTT完全混匀后,用0.22um滤膜过滤以除去溶液里的细菌,分装锡箔纸避光可长期保存于-20℃。

三、实验步骤(贴壁细胞)

1.   按实验要求处理实验组及对照组细胞(knock down/over express)

2.   接种细胞:消化对数期细胞,用含10%FBS的培养液重悬细胞,铺96孔板使待测细胞密度至1000cell/孔(根据细胞生长快慢决定铺板密度),每孔总体积(细胞悬液+培养基)200ul(边缘孔用无菌PBS填充,且同样加MTT、DMSO处理)。

3.   铺好后,摇匀细胞,镜下观察细胞密度,培养箱培养。按照一定的时间梯度(1,2,3,4天…)处理细胞。

4.   每孔(含边缘孔)加入20ul MTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。(若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液。)

5.   终止培养,小心吸去孔内上清液,不要吸掉孔板底部的甲瓒颗粒,

6.   每孔加入100ul DMSO,置摇床上低速震荡3-5min,使结晶物充分溶解。

7.   比色:在酶标仪490nm处测量各孔的OD值,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。(转运时用泡沫盒,避光)

四、注意事项:

1.    在配制和保存的过程中,要求避光。(实验时可关闭超净台的日光灯来避光,96孔板加时可不避光,毕竟时间较短),配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感。

2.    MTT干粉存于2-8℃避光,一般最好现用现配,过滤后4度避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当MTT变为灰绿色时不能再用。

3.    MTT有致癌性,用时戴薄膜手套.

4.   在用酶标仪检测结果的时候,为了保证实验结果的线性,MTT吸光度最好在0-0.7 范围内。

5.   如果药物本身有颜色,那么采用MTT法可以通过离心去除颜色的干扰,多次的离心和吸取上清要求操作者要小心和仔细,否则会降低试验的准确率。

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