河南大学师冰洋课题组:单个siRNA纳米胶囊治疗脑胶质瘤

好久不见,甚是想念。实验太忙,更新较慢。还请见谅,继续努力。

课题组背景

师冰洋  博士,教授,博士生导师
2006年毕业于河南大学,获生物工程学士学位;2009年毕业于华东理工大学,获生物医学工程硕士学位;2013年毕业于澳大利亚阿德莱德大学,获生物医学博士学位;2016年被河南大学聘为“攀登计划”特聘教授,任河南大学—麦考瑞大学生物医学联合创新中心执行主任。
研究方向
1)基于纳米技术策略穿越血脑屏障的机理;
2)脑靶向药物输送载体的设计;
3)脑疾病治疗临床前评估。
文章背景

▪ 脑胶质瘤目前尚无有效的治疗手段,主流的方法是先通过手术切除肿瘤后进行化疗或者放疗,然后由于该类肿瘤细胞浸润程度高,复发率高,术后的生存期较短,属于一种无法根治的疾病。

▪ siRNA被认为是一种有效的肿瘤治疗新方法,然而基于该类疗法的脑胶质瘤治疗却受到很多因素的限制。包括稳定性差,血液循环短,血脑屏障渗透率低,低效率的肿瘤蓄积以及siRNA细胞内释放。

▪ 基于以上问题,本文作者为单个siRNA穿上了一层聚合物外衣,链接靶向多肽后实现了脑胶质瘤的siRNA高效靶向递送治疗。

文章主要内容

Figure 1. 课题设计思路

 该纳米胶囊的制备使用了自由基聚合法。

 由于siRNA带负电,作者制备了一个含有丙烯酸酯键的胍基化试剂,将其预先与siRNA吸附在一起,从而保证了自由基聚合能在siRNA表面发生。

 接着在体系中引入了GSH敏感的二硫键和PEG-NHS的丙烯酸酯结构,然后加入APS和TEMED引发自由基聚合。

 在siRNA表面包裹一层聚合物后,加入含氨基的Angiopep-2多肽进行酰胺化反应,进而连接到纳米胶囊的表面。

 该纳米胶囊能够通过脑血管内皮细胞和肿瘤细胞表面高表达的LRP-1受体内吞进入肿瘤细胞。在细胞内高浓度的GSH作用下,siRNA在胞浆内快速释放,进而达到治疗肿瘤的目的。

Figure 2. 纳米胶囊的表征及敏感性考察

 图A 粒径分布图。通过DLS测得该纳米胶囊粒径约为25.3 nm,PDI 0.21,与游离的siRNA的5 nm粒径对比可以说明,siRNA表面已聚合上一层polymer。

 图B 纳米胶囊TEM成像。呈现均匀分布的球形,与DLS测得的粒径相符。

 图C siRNA血清稳定性考察。考察裸siRNA和纳米胶囊在有无FBS的情况下siRNA的稳定性,可见裸siRNA与血清孵育1h后便大量降解,而纳米胶囊则较为稳定。

 图D siRNA释放动力学。在GSH的环境下,siRNA能够快速实现80%的siRNA释放,而对照组则仅有20%的释放。

Figure 3. 纳米胶囊的BBB和体内穿透及基因沉默效果考察

 图A siRNA血脑屏障跨越效率测定。体外BBB模型中,检测不同组别Cy5标记的siRNA跨越BBB后的比例,可见靶向多肽的修饰在不同时间段可以大大提高siRNA的跨BBB效率。

 图B 细胞摄取定量分析。孵育24h后,流式细胞仪检测BBB模型下层肿瘤细胞对Cy5标记的siRNA摄取。定量结果显示,靶向多肽修饰的纳米胶囊能够显著提高siRNA的跨BBB效率。

 图C 细胞摄取机制。激光共聚焦考察下层肿瘤细胞摄取siRNA后与溶酶体共定位情况,靶向多肽修饰的纳米胶囊能够穿过BBB被更多的摄取,并且能够实现溶酶体逃逸。

 图D 细胞活力检测。MTT结果显示,在不同给药的浓度下,U87细胞对制剂未显现出明显的毒性,可见该纳米胶囊具有良好的生物相容性。

 图E、F 基因沉默效率考察。使用荧光素酶和PLK1的siRNA作为模型siRNA进行给药,靶头组荧光素酶和PLK1的基因沉默效果较好。

 图G PLK1蛋白表达水平考察。WB分析PLK1蛋白表达水平与上述基因沉默效果相符。

 图H 促凋亡效果考察。靶头组能够促进较多的肿瘤细胞发生凋亡,这与其较高的摄取正相关。

 图I 体内纳米胶囊肿瘤部位靶向穿透考察。(核:DAPI,绿色:CD31血管,红:Cy5标记的siRNA)荧光成像结果显示,靶头制剂组肿瘤部位蓄积更多,穿透更深。

Figure 4. 纳米胶囊的体内靶向及分布考察

 图A siRNA体内动力学。通过不同时间点荧光检测血液中Cy5标记siRNA的浓度,制剂组能够显著提升siRNA体内的稳定性。

 图B siRNA体内分布。通过活体成像展现siRNA在给药后24h内的体内分布情况,靶头组在脑部有着更高及更久的蓄积。

 图C、D 给药后脑部肿瘤Luci信号表达情况。可见靶头组肿瘤信号在72h时显著降低。

 图E 离体器官肿瘤及Cy5信号表达情况。靶头组能够显著减少肿瘤信号并提高脑内siRNA的蓄积。

 图F 组织分布定量考察。通过测定组织匀浆中siRNA的荧光强度来确定各组织部位的siRNA分布量。

Figure 5. 纳米胶囊的体内药效考察

 图A、B 模型小鼠肿瘤信号监测。给药20天左右,活体成像可见制剂组肿瘤的Luci信号显著降低。

 图C、D 荷瘤小鼠的体重及生存变化。制剂组能够提高肿瘤小鼠的中位生存期。

 图E 肿瘤部位TUNEL和Ki67染色。制剂组能够显著促进肿瘤的凋亡并抑制其增殖。

总结:这篇文章做的脑胶质瘤治疗相关实验可谓是中规中矩,没有太多华丽的数据,但亮点就在于制剂的设计。近两年自由基聚合都是大文章,而且很有设计感。但合成可控性不是很好,较为困难,之前尝试过结果也不是很好。

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