实验教程:凋亡细胞的普通光镜观察(一)

瓜瓜师姐今天继续给大家分享实验技术,今天给大家分享凋亡细胞的普通光镜观察——苏木精-伊红(HE)染色教程,希望能够对大家有帮助~

为了方便大家阅读,先奉上目录思维导图:

01  原理与应用

  • 苏木精:苏木精易溶于乙醇、甘油及热水中,本身与组织亲和力小,不能成为染液,只有加入复盐和氧化剂方能成为染液,此时苏木精被氧化为苏木红,且与铝离子结合形成一种蓝色、带正电荷的碱性染料,可与细胞核中的脱氧核糖核酸根(带负电荷)结合完成染色。
  • 伊红:伊红Y是一种红色酸性染料,为细胞质染色剂,一般配成0.5%~1%的乙醇溶液。
  • HE染色:在苏木精染色后,经伊红复染,95%乙醇分色。苏木精-伊红染色简称HE染色。
  • 细胞凋亡:细胞发生凋亡时,其形态产生一系列变化,如核染色质固缩、边集,染色较深,或核破裂甚至出现凋亡小体等,经HE染色,在普通光镜下即可观察到相应的变化。

02  仪器与设备

  • 材料:Hela细胞(或别的细胞),染色缸、载玻片(预先经多聚赖氨酸或其他贴片剂处理)、盖玻片、计数板、10ml吸管、吸管橡皮球、15ml离心管、微量移液器吸头。
  • 试剂:凋亡诱导剂(根据情况自定)、固定液(4%甲醛,或多聚甲醛)、磷酸缓冲液(PBS)、消化液(0.02%EDTA)、苏木精染液、1%伊红Y的乙醇溶液、梯度乙醇、二甲苯、分化液(75%乙醇-0.5%盐酸)、中性树脂。
  • 设备:细胞涂片离心机、超净台、37℃ CO2孵箱、相差倒置显微镜、普通显微镜、100ul微量移液器。

03  试剂配制

  • 苏木精染液:苏木精1g,蒸馏水100ml,碘酸钠0.2g,钾矾50g,加温溶解后加入水化氯醛50g,枸橼酸1g,搅拌溶解后可长期保存。

04  细胞涂片HE染色实验步骤

  • 制备细胞涂片:培养细胞,诱导凋亡,然后消化细胞,制成单细胞悬液。将单细胞悬液移至离心管,离心(1000g)5min,弃上清液并用PBS洗细胞1~2次后,制备细胞悬液,并调整细胞数至(1~5)×104个/ml,取100ul细胞悬液,用细胞涂片离心机(1000g,1~2min)制成细胞涂片。4%甲醛(或多聚甲醛)固定10min后染色。
  • 染色:苏木精染液染色3min,自来水洗1min。
  • 分化:在分化液中分化30s(提插数次)后用蒸馏水浸泡5~15min。
  • 染色:伊红染液染色2min。
  • 脱水:脱水、透明75%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇(I)、100%乙醇(Ⅱ)、二甲苯(I)和二甲苯(Ⅱ)各1min以脱水透明。
  • 封片:中性树脂封片。
  • 观察:普通显微镜观察。

05 注意事项

  • 甲醛、二甲苯均有毒,而且甲醛有致癌作用,所以相关操作应戴手套等、在通风橱进行。
  • 制备细胞涂片过程中,应将在消化前已脱壁的细胞收集在内。

06 实验结果与分析

  • 细胞核蓝色,细胞质红色。凋亡细胞的核染色质固缩、边集,染色较深,或核破裂。
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