实验教程:凋亡细胞的荧光显微镜观察

瓜瓜师姐今天给大家更新凋亡细胞的荧光显微镜观察实验教程~

为了方便大家阅读,先奉上目录思维导图:

(一)Hoechst33258染色法

01  原理与应用

  • 凋亡状态:细胞凋亡时,其核染色质的DNA出现缺口甚至断裂,致使染色质凝聚、边缘化甚至呈现DNA碎片。
  • 利用与DNA结合的荧光染料染色后,在荧光显微镜下即可观察到上述变化。
  • Hoechst33258为与A-T结合的特异性DNA染料,对活细胞和固定细胞均能染色。

02  仪器与设备

  • 材料:HeLa细胞(或别的细胞),载玻片、盖玻片、计数板、10ml吸管、吸管橡皮球、10ml离心管、微量移液器吸头、滴管、滴管橡皮头。
  • 试剂:凋亡诱导剂(根据情况自定)、固定液(4%甲醛,或多聚甲醛)、磷酸缓冲液(PBS)、消化液(0.02%EDTA)、Hoechst33258染液。
  • 设备:计数板、相差倒置显微镜、超净台(实验前紫外照射30min)、离心机、37℃ CO2孵箱、荧光显微镜、微量移液器。

03  试剂配制

  • Hoechst33258染液:Hoechst332581mg;加入蒸馏水1ml。

04  实验方案

  • 诱导凋亡:培养细胞,诱导凋亡(在超净台进行)。
  • 收集细胞:收集细胞先用滴管轻轻吹打,收集已脱落的细胞至离心管。加入适量的0.02%EDTA(3~4ml)消化未脱壁细胞并收集至上述离心管。1000g离心5min,弃上清液(悬浮细胞直接收集)。
  • 漂洗:PBS(37℃)漂洗悬浮细胞。
  • 固定:固定液(4℃)固定5min,500~1000g离心5min,弃上清液。
  • 水洗:蒸馏水洗,500~1000g离心5min,弃上清液。
  • 调整细胞数:调整细胞数至(0.5~2.0)×105个/ml。
  • 加染液:取100ul细胞悬液,加入1ul Hoechst33258染液,10min。
  • 涂载玻片:将10ul染色的悬浮细胞涂于载玻片,加盖玻片。
  • 荧光观察:荧光显微镜下观察。选用UV激发滤片和400~500nm阻断滤片。

05 注意事项

  • Hoechst33258染液应4℃避光保存。提示学生小心甲醛。

06 实验结果及分析

  • Hoechst33258染色:细胞核呈蓝色。凋亡细胞的核染色质凝聚且边缘化,或玻珠化,并可呈现DNA荧光碎片。

(二)吖啶橙-溴化乙锭(AO-EB)染色方法

01  原理与应用

  • 吖啶橙染色:吖啶橙(acridine orange,AO)能同时与DNA和RNA结合,对活细胞和死细胞均能染色。
  • 溴化乙锭染色:溴化乙锭(ethidium bromise,EB)插入双链核酸,对失去膜完整性的细胞染色。

02  仪器与设备

  • 材料:HeLa细胞(或别的细胞)、载玻片、盖玻片、计数板、10ml吸管、吸管、橡皮球、10ml离心管、微量移液器吸头、滴管、滴管橡皮头。
  • 试剂:凋亡诱导剂(根据情况自定)、固定液(4%甲醛,或多聚甲醛)、磷酸缓冲液(PBS)、消化液(0.02%EDTA)、AO染液、EB染液。
  • 设备:计数板、相差倒置显微镜、超净台(实验前紫外照射30min)、离心机、37℃CO2孵箱、荧光显微镜、微量移液器。

03  试剂配制

  • AO染液:吖啶橙100μg加入PBS 1ml。
  • EB染液:溴化乙锭100μg加入PBS ml。

04  实验方案

  • 诱导凋亡:培养细胞,诱导凋亡(在超净台进行)。
  • 收集与离心:收集细胞先用滴管轻轻吹打,收集已脱落的细胞至离心管。加入适量的0.02%EDTA(3~4ml)消化未脱壁细胞并收集至上述离心管。1000g离心5min,弃上清液(悬浮细胞直接收集)。
  • 漂洗:PBS(37℃)漂洗悬浮细胞。
  • 固定:固定液(4℃)固定5min,500~1000g离心5min,弃上清液。
  • 水洗:蒸馏水洗,500~1000g离心5min,弃上清液。
  • 调细胞数:调整细胞数至(0.5~2.0)×106个/ml。
  • 加染液:取25ul悬浮细胞滴于载玻片上,加入1μlAO-EB(1:1)染液,轻微混合。
  • 封片:直接用盖玻片封片。
  • 荧光观察:在装有荧光滤光片的荧光显微镜下观察。

05 注意事项

  • EB为强诱变剂,有中度毒性操作时应戴手套。EB污染物及废弃液应单独存放。小心甲醛。

06 实验结果及分析

  • AO-EB染色:细胞呈均匀的绿色
  • 凋亡早期细胞的核中有鲜绿色的斑点。
  • 晚期凋亡细胞核呈红色,核染色质凝聚并常常裂解。

结语

希望瓜瓜的分析能够对大家的实验有帮助~

日后还会分享更多实验技术,欢迎大家关注我哦!

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