实验教程:凋亡细胞的电镜观察

今天给大家分享凋亡细胞的电镜观察教程,希望能够对大家有帮助~

为了方便大家阅读,先奉上目录思维导图:

01  原理与应用

  • 凋亡细胞的变化特点:凋亡细胞除染色质发生变化外,其亚细胞结构也出现相应的变化,如核破裂,形成电子密度增强的膜包体;细胞膜芽生出泡,凋亡小体形成等。这些变化在分辨率较高的电子显微镜下能很好显示。
  • 电子显微镜:电子显微镜使用电子束来对样品成像,将分辨率自光镜的0.2um提高到约0.2nm,可为细胞死亡类型提供最确切的证据。电子束与样品中的原子相互作用可产生弹性散射和非弹性散射,弹性散射和非弹性散射联合作用产生了最终的图像。用铅、铀和锇等重金属对生物样品的特定区域进行染色,可以增加该区域的弹性散射,加强图像的对比度。此外,透射电子显微镜样品的固定、脱水及切片厚度均与光镜不同。

02  仪器与设备

  • 材料:已诱导凋亡的细胞,染缸、10ml的锥形离心管、500ml锥形瓶、塑料棒蕊、胶囊、10ml吸管、吸管橡皮球。
  • 试剂:消化液(0.02%EDTA)、PBS、蒸馏水、琼脂糖、乙醇-树脂(1:1)、树脂、醋酸铀-柠檬酸铅、4%多聚甲醛/0.1mol/L磷酸缓冲液、1%锇酸(二甲胂酸钠缓冲液配制)、梯度乙醇。
  • 设备:微波炉、离心机、恒温烤箱、超薄切片机、透射电镜。

03  试剂配制

  • 0.2mol/L磷酸缓冲液(储备液):甲液:磷酸氢二钠Na2HPO4·2H2O35.61g加蒸馏水至1000ml;乙液:磷酸二氢钠Na2 HPO4·2H2O 27.60g加蒸馏水至1000ml。
  • 工作液(pH7.2):甲液(36.0ml)+乙液(14.0ml)总50ml。
  • 工作液(pH7.4):甲液(40.5ml)+乙液(9.5ml)总50ml。

04  实验步骤

  • 制备琼脂离心管:用蒸馏水将琼脂配成20g/L溶液,加热溶解。灌入一10ml的锥形离心管,其中央竖放一下端尖细的棒蕊,凝固后抽出棒蕊,备用。
  • 收集细胞:将消化的贴壁细胞放入离心管,1000r/min离心5min,弃上清液,用冷PBS(4℃)洗,5mlPBS悬浮细胞并将其加入琼脂离心管。2000r/min离心15min,弃上清液。
  • 固定:加入适量的4%多聚甲醛固定15min后取出离心管中的琼脂块,用刀修出含细胞团的琼脂块(可放入含4%多聚甲醛的小瓶,在4℃下长期保存)。
  • 洗涤:PBS(4℃)洗3×5min。
  • 固定:1%锇酸(4℃)固定30min。
  • 洗涤:蒸馏水(4℃)洗3×5min。
  • 脱水:30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、100%乙醇(I)和100%乙醇(Ⅱ)各2min。
  • 浸透:1:1的乙醇:树脂60min,100%的树脂2×60min。
  • 包埋:将胶囊放置60℃恒温烤箱2h,将包埋剂灌入胶囊并放置标签;将细胞团的琼脂块移至胶囊的中央,静置,使其自然沉降至胶囊的底部后,置于60℃恒温烤箱48h。
  • 切片。
  • 染色:醋酸铀-柠檬酸铅染色。
  • 电镜:TEM下观察。

05 注意事项

  • 多聚甲醛、二甲胂酸钠、锇酸:吸入、摄入或经皮肤吸收有毒。提示实验人员相关操作应戴手套及防护镜,在化学通风橱进行。

06 实验结果及分析

  • 早期凋亡细胞的核染色质边集于核膜周边呈新月形。
  • 随着凋亡进展,可观察到核固缩、电子密度增加,核形不规整;进而核破裂,形成电子密度增强的膜包体;细胞体积变小,胞浆浓缩且气泡化;细胞器完好或轻度增生,线粒体轻度肿胀且数目稍有增加;细胞膜完整,可出现芽生出泡现象。
  • 晚期凋亡细胞可见凋亡小体。
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