实验教程:凋亡细胞的流式细胞法检测

瓜瓜师姐今天给大家分享|凋亡细胞的流式细胞法检测实验技术教程,希望能够对大家有帮助~

为了方便大家阅读,先奉上目录思维导图:

01  原理与应用

  •  

    经染色后每一细胞结合的DNA特异染料(PI)与其DNA含量成正比,而细胞受激发后发射的荧光强度与结合PI的量成正比。

    利用此特点流式细胞仪可将处于不同细胞周期的细胞分开。

  • 凋亡细胞的染色质凝聚,DNA被裂解,在制备样品过程中,低分子的DNA片段扩散,加之凝聚的染色质排斥染色,致使凋亡细胞的可染性降低,在直方图的G0/G1期峰前出现亚二倍体区。

02  仪器与设备

  • 材料:HeLa细胞,微量移液器吸头,400目的筛网、10ml 离心管。
  • 试剂:凋亡诱导剂(根据情况自定)、0.02%EDTA、PBS(pH 7.2)、PI染液、100%乙醇(冰箱保存)、RNase(10mg/ml)。
  • 设备:微量移液器、流式细胞仪。

03  试剂配制

  • PI染液:100mg/L 的PI,1.0%的Triton X-100,0.9g/L的NaCl。4″C保存。

04  实验步骤

    • 收集细胞
    • 洗涤:冷PBS洗2次后制成2X106个/ml细胞悬液。
    • 固定:加入冷100%乙醇(乙醇:细胞悬液=7↓3),4C固定12h以上。
    • 洗涤:冷PBS洗2次。
    • 加RNase A(:用500μl PBS重新悬浮细胞,加入RNase A(终浓度为0.1mg/ml)。
    • 过滤:400目尼龙网过滤。
    • 加PI:加PI 800μl,4C保持30min。
    • 流式:流式细胞仪分析。

05 注意事项

  • PI:吸入、摄入或经皮肤吸收均有害。
  • 戴手套,穿白大衣在化学通风橱内进行相应的操作。

06 实验结果与分析

  • 细胞碎片:检验样品前,通过调整流式细胞仪的域值排除细胞碎片。细胞碎片前散射光(FSC)、侧散射光(SSC)和FL2都很低,凋亡细胞的SSC高,FL2中等。
  • 凋亡细胞:凋亡细胞在直方图的亚二倍体区。在FSC对SSC的散点图上,与正常细胞相比,凋亡细胞的前散射光降低,侧散射光可高可低依细胞类型而定。此外,凋亡细胞在直方图的Go/GI期峰前出现亚二倍体区。
基础实验

实验教程:凋亡细胞的电镜观察

2020-8-15 16:53:04

基础实验

技术:Thermal Shift Assay (热漂移检测)

2020-8-16 12:27:57

加入Q群
0 条回复 A文章作者 M管理员
    暂无讨论,说说你的看法吧
个人中心
今日签到
有新私信 私信列表
搜索