实验教程:凋亡细胞的原位末端标记法检测

瓜瓜师姐今天给大家分享凋亡细胞的原位末端标记法检测实验技术教程,希望能够对大家有帮助~

为了方便大家阅读,先奉上目录思维导图:

01  原理与应用

  • 凋亡早期:在凋亡早期,激活的细胞内源性的核酸内切酶,作用于染色质核小体间的DNA,使其产生缺口,甚至断裂。
  • TdT能催化DNA链的3′-OH端加脱氧核糖核苷酸(dNTP)的聚合反应。
  • 将地高辛配基偶联于dUTP(Dig-dUTP),在TdT的催化下,Dig-dUTP 的核苷酸基加合到DNA缺口处或断端形成的3′-OH上,同时释放出焦磷酸(ppi)。使用辣根过氧化物酶标记的地高辛抗体,通过抗原抗体反应与地高辛配基结合,3’,3-二氨基联苯胺(DAB)显色,即可在普通光学显微镜下观察到其染色质DNA存在缺口或断裂的细胞。

02  仪器与设备

  • 材料:HeLa细胞(或别的细胞),载玻片、盖玻片、计数板、10ml吸管、吸管橡皮球、10ml离心管、微量移液器吸头、滴管、滴管橡皮头、盖玻片、Parafilm膜。
  • 试剂:中性树脂凋亡诱导剂(根据情况自定)、消化液(0.02%EDTA)、PBS、4%多聚甲醛(0.1mol/L PBS,pH 7.4)、3%H2O2(避光保存)、蛋白酶K、孵育液、5X TdT反应缓冲液、末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)(4U/pl)、Dig-dUTP(40~ 80μmol/L)、双蒸水、10X DAB H2O2显色液、苏木精染液。
  • 设备:湿盒、微量移液器及其吸头、普通显微镜。

03  试剂配制

  • 孵育液:100mmol/L二甲胂酸钾(pH 7.2),2mmol/L CoCl2,0.2mmol/L DTT,150mmol/L NaCI,0.05%BSA.
  • 蛋白酶K:20μg/ml[10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)配制]。
  • 5X TdT反应缓冲液:500mmol/L 二甲胂酸钾(pH 7.2),10mmol/L CoCl,1mmol/L DTT。.
  • 10XDAB-H2O2显色液:0.1mol/L Tris-HCI(pH 7.6),0.4%DAB,-20℃避光保存,用前稀释10倍并加入H2O2.

04  实验步骤

  • 样品处理:玻片预先用多聚赖氨酸或APES进行处理。制备细胞涂片:4%多聚甲醛0.1mol/LPBS(pH7.4)室温固定1h。
  • 洗涤:PBS 洗3X 5min。
  • 封闭:3%H2O2室温处理10min,封闭内源过氧化物酶活性。PBS洗2X3min。.
  • 蛋白酶K:蛋白酶K室温处理10~60s,PBS洗3X 3min.
  • 孵育:加30ul孵育液,Parafilm 膜覆盖,室温孵育10min。取下Parafilm 膜,用纸巾吸去水。
  • 加反应缓冲液:4μl 5XTdT反应缓冲液十1μl TdT+ 1μl  Dig-dUTP+14μl双蒸水,混匀后滴加在标本上,Parafilm 膜覆盖,37℃孵育1~2h。取下Parafilm 膜,PBS 洗3X 2min.
  • 加抗体:加20~50μl 5U/ml的辣根过氧化物酶偶联的地高辛抗体,Parafilm膜覆盖,37°C孵育30min。取下Parafilm 膜,PBS 洗3X 2min.
  • 显色:0.04%的DAB显色5~10min,镜下控制时间。过量的水清洗。
  • 复染:苏木精(或甲基绿)轻度复染30s~3min。过量的水清洗。
  • 观察:常规脱水、透明、封片。普通显微镜下观察。

05 注意事项

  • 多聚甲醛、DAB:致癌。应戴手套,在通风橱操作。
  • 废弃物和废液应单独存放。

06 实验结果与分析

  • 凋亡细胞的细胞核中出现棕黄色或棕褐色颗粒,细胞核的形状不规整,大小不一。
  • 正常细胞的细胞核在苏木精复染后呈蓝色,核相对较大,形态、大小较为一致。
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