细胞库分类及病毒检测介绍

摘要

COVID-19新型冠状病毒疫情已经发展成全球流行性疾病,生物制品的安全性也再次引起人们的关注。细胞库作为生物制品生产制备的基本原料,一旦污染将会严重影响产品的安全性。义翘神州结合CFDA、ICH等多个国内外法规及指导原则,已建立全面系统的细胞库检定体系,为合作伙伴提供完整的细胞库检测服务。现邀请细胞库负责人李晴晴举办了一场在线讲座,将分享细胞库检定的意义及如何系统的进行细胞库检测相关内容。

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生物制品行业已制定多项安全法规,以防止因其污染造成的安全事件,比如《中国药典》2015版,就明确指出生物制品生产用细胞需要进行检定。
义翘神州结合CFDA、FDA、EMEA、ICH等多个国内外法规和指导原则,建立了全面的细胞库检定方法,主要包括细胞鉴别、细菌真菌检查、支原体检查、分枝杆菌检查、体外法和体内法检测外源病毒因子、种属特异性病毒分子检测、牛源病毒检测、猪源病毒检测、鼠细小病毒检测等多个技术型平台。义翘神州已经完成多个CHO、HEK293等原始细胞库、主细胞库、工作细胞库的检测,为合作伙伴提供完整的细胞库检测服务。

义翘神州细胞库检测实验室一角
 
细胞库按照规定实行三级管理制度,即始细胞库、主细胞库及工作细胞库。
原始细胞库(PCB)由一个原始细胞株/系经过稳定传代形成的细胞群体,或者是经过克隆培养而形成的均一细胞全体,通过检定证明适用于生物制品生产或检定。原始细胞库需在特定条件下,冻存于液氮中或零下130度,用来建立主细胞库。
主细胞库(MCB)来自原始细胞库,通过一定方式进行传代、增殖后均匀混合成一批,定量分装后,冻存于液氮中或零下130度。主细胞库必须按照特定的质控标准进行全面检定,全部合格后才可用于建立工作细胞库。
工作细胞库(WCB)也需经过严格的检定合格后才可用于生产。工作细胞库由主细胞库经过传代、增殖,形成的均质细胞悬液,冻存于液氮中或零下130度。冻存时细胞的传代水平须确保细胞复苏后传代增殖的细胞数量能够满足一个批次的生物制品。
 

各级细胞库经过细胞形态、化学反应、免疫学检测、细胞遗传学检测、遗传标志检测等确定没有被其它种类的细胞污染,并且对细胞库病原微生物进行检测。义翘神州采用薄膜过滤法,在B+A级环境条件下检测细胞库样品含有的细菌和真菌。利用培养法和DNA荧光染色法进行支原体检测。义翘神州提供的肺炎支原体和口腔支原体检测灵敏度远高于药典要求。对于分歧杆菌,义翘神州同样采用培养法进行检测。
 

细胞库检定的重点是检测细胞系/株中是否存在潜在可传染的病毒,以及使用的原材料或操作中是否带入外源性病毒。细胞库病毒检测的种类和方法,可以耿军细胞的种属来源、组织来源、细胞特性、传代历史、培养方法及过程等确定。如果主细胞库进行了全面检定,工作细胞库需检测的外源病毒种类可主要考虑从主细胞库到工作细胞库过程中可能引入的病毒,而仅存在于建主细胞库前的病毒可不再重复检测。对此,义翘神州建立了完整严格的细胞库内源性和外源性病毒检测体系。
 

 
采用透射电镜检查法、逆转录酶活性测定和感染性试验,准确的检测样品中是否含有逆转录病毒及其他内源性病毒。透射电镜检查法能显示病毒、病毒样颗粒与细胞污染相关的微生物的大小、结构和细胞内位置。逆转录酶活性测定以噬菌体MS2 RNA为模板,采用实时荧光定量PCR法,确定是否存在逆转录病毒。通过感染实验进行传代培养,利用PG-4细胞空斑病变法评估逆转录病毒是否具有感染性。
 

针对种属特异性外源病毒,义翘神州建立了分子方法检测鼠源病毒和人源病毒,检测方法快捷灵敏。比如人EB病毒、人巨细胞病毒、人肝炎病毒、人乳头瘤病毒等,猴源细胞考虑检测猴多瘤病毒(SV40)、猴免疫缺陷病毒(SIV)等。
如果在生产建库之前、细胞基质建立或传代过程中使用了牛血清,则需要检测牛源性病毒。义翘神州利用多种技术对牛副流感病毒、牛腹泻病毒、牛腺病毒等6种病毒进行检测。如果细胞基质在建立或传代历史中使用了胰酶,则需要检测与胰酶来源动物相关的外源性病毒,如猪细小病毒、猪细环病毒等。有些细胞对某些特定病毒易感,需要采用特定的方法检测,比如CHO细胞检测鼠细小病毒的污染等。
 

 
成瘤性和致瘤性也是细胞库特性检定的参数。成瘤性检查确定细胞在动物体内能否形成肿瘤,致瘤性检查是保证细胞基质中不存在可使细胞永生化并具有形成肿瘤的因子。义翘神州采用裸鼠皮下注射的方法检测样品是否具有成瘤性,用细胞基质裂解物接种动物进行致瘤性检查。

展望

随着生物制品行业的蓬勃发展,生物制品的安全性越来越受到人们的广泛关注,细胞库检测的市场需求是巨大的。
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