国自然专题:国自然基金热点——RNA甲基化修饰m6A

2019年国家自然科学基金竞争十分激烈,全国共有1400多家单位申报的项目获得立项,立项总数为41752项。总资助金额超过210亿元。其中,医学科学部共批资助10138项(不含杰出青年基金项目),批准资助金额共计44.13亿元,单项平均资助金额43.53万元。大热门赢家是m6A和非编码RNA,RNA甲基化特别是m6A方向的增长简直是激动人心!至少140项资助项目涉及此热点,而2018年只有67项,整整翻了一倍!对于2021年的基金申请,吉康医学依然看好m6A热点。

N6-腺苷酸甲基化修饰(m6A)的概述

说起RNA甲基化,已知RNA存在超过100种修饰。在真核生物中,5’端的Cap以及3’的ployA修饰在转录调控中起到了十分重要的作用,而mRNA的内部修饰则用于维持mRNA的稳定性。mRNA最常见的内部修饰包括N6-腺苷酸甲基化(m6A)、N1-腺苷酸甲基化(m1A)、胞嘧啶羟基化(m5C)等。

早在20世纪70年代,研究者就发现了N6-甲基腺苷(m6A)修饰,m6A是能够发生在mRNA、长链非编码RNA(lncRNA)等RNA腺嘌呤(A)上的甲基化修饰。在目前已知的171种RNA转录后修饰中,m6A是大多数真核生物mRNA和lncRNA中最丰富的修饰之一,占哺乳动物RNA中腺苷酸的0.1%-0.4%和核糖核苷酸总甲基化的50%。除了在植物和脊椎动物中存在着广泛的m6A修饰外,在单细胞生物如细菌、酵母等RNA中也发现了这种修饰。m6A修饰主要发生在RRACH(R = G或A,H = A,C或U)共有序列中,通过高通量测序发现,m6A并不是随意分布,而是在终止密码子、3′ 非翻译区(3′ UTR)、以及内部长外显子区域聚集,并且在前体mRNA中发现的更多。类似于DNA甲基化、组蛋白修饰等表观遗传修饰,m6A甲基化参与细胞活动中重要功能基因精细而复杂的生物学调控。越来越多的研究表明,m6A修饰参与了人类复杂疾病的发生过程,尤其在癌症的发生发展中扮演着重要的角色。

m6A修饰的影响因子

m6A这种甲基化修饰被证明是可逆化的,包括甲基化转移酶(Writers)、去甲基化酶(Erasers)和甲基化阅读蛋白(Readers)等共同参与了修饰过程。其中甲基化转移酶包括METTL3/14、WTAP和KIAA1429等,主要作用就是催化mRNA上腺苷酸发生m6A修饰。而去甲基化酶包括FTO和ALKHB5等,作用是对已发生m6A修饰的碱基进行去甲基化修饰。甲基化阅读蛋白主要功能是识别发生m6A修饰的碱基,从而激活下游的调控通路如RNA降解、miRNA加工等。

1、m6A甲基化转移酶(Writers)

甲基化转移酶(methyltransferase)也叫Writers,是一类重要的催化酶,能够让mRNA上的碱基发生m6A甲基化修饰。METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1492都属于m6A甲基化转移酶的核心蛋白。这些蛋白并不是各自孤立的,而是会形成复合物(complex)共同行使催化功能。由于酵母和线虫等生物缺少这四种核心蛋白中的一种或几种,所以m6A甲基化修饰属于高等真核生物独有的碱基修饰反应。

2、m6A去甲基化酶(Erasers)

在真核生物中,已发现的m6A去甲基化酶主要包括FTO和ALKBH5等。FTO蛋白全称Fat mass and obesity-associated protein,属于Alkb蛋白家族中的一员并且与肥胖相关,FTO被敲除或过表达都会显著改变小鼠的体重。ALKBH5是另一种重要的去甲基化酶,能够对细胞核中的mRNA进行去甲基化修饰,在N端有丙氨酸富集区和独有的卷曲螺旋结构(coiled-coil structure)。在细胞系中敲低ALKBH5后,mRNA上m6A修饰水平显著上升。

3、m6A甲基化阅读蛋白(Readers)

RNA pull-down实验已经鉴定了多种阅读蛋白,包括YTH结构域的蛋白、核不均一核糖蛋白(hnRNP)以及真核起始因子(eIF)等。YTHDF1-3主要在胞浆中特异性识别m6A修饰的mRNA,而YTHDC1-2的作用部位主要在细胞核内。eIF3蛋白能够与RNA 5’端UTR上发生m6A修饰的碱基相结合,从而促进mRNA的翻译。

m6A修饰的功能

1、影响mRNA前体的剪接

mRNA前体的剪接是基因表达中的重要步骤,它涉及内含子的精确切除和初级转录本外显子的连接以产生成熟的mRNA。最早提出的m6A的作用,是作为RNA剪接的调节剂。目前已有许多证据支持m6A与RNA剪接的相关性,但确切的机制尚不清楚。例如,从METTL3敲低的HepG2细胞的m6A-IP/RNA-seq数据分析显示,许多基因特别是甲基化基因显示异构体水平的差异表达,但是基因水平并无差异。同时,剪接的外显子和内含子富集m6A峰,表明m6A与mRNA的选择性剪接之间的内在联系。m6A对RNA剪接的作用可能是由于甲基化的发生会干扰剪接因子和mRNA之间的相互作用,m6A簇可能作为某些RNA结合蛋白的对接位点;或者,由于m6A使A-U碱基配的稳定性降低,RNA二级结构受到影响。

2、调控RNA的核输出

RNA剪接后,成熟的mRNA必须从细胞核中输出以在细胞质中翻译或降解。研究者检测到STH处理的HeLa细胞中细胞核mRNA的保留时间增加了40%,但是多聚腺苷酸化的RNA没有变化。在具有增强m6A水平的ALKBH5缺陷型细胞中,通过5-溴尿苷(BrU)掺入分析观察到新生合成的RNA主要分布在细胞质中。据报道,不同的RNA种类通过核孔复合物利用不同的途径进行核输出。TAP-P15复合体是在衔接蛋白如ALY/REF衔接子、SR蛋白和TREX复合物的协助下用于mRNA输出。由于ASF/SF2的磷酸化水平决定其在剪接或核输出中的功能,因此推测由ALKBH5缺陷引起的ASF/SF2磷酸化减少将加强其与TAP/P15复合物的相互作用从而导致核mRNA输出加速。与mRNA不同,rRNA可以招募几种不同的途径使其出口更有效率。rRNA核出口可能不会受到ALKBH5缺陷的显着影响。

3、调控mRNA翻译

大多数m6A修饰发生在外显子,在剪接后m6A仍保留在成熟的mRNA中。因此,m6A也可以影响含该修饰mRNA的翻译。小鼠DHFR mRNA体外甲基化后用兔网织红细胞系进行体外翻译,在比较甲基化转录物的翻译水平和非甲基化转录物的翻译水平时,检测到甲基化mRNA的翻译水平增加1.5倍。当从环亮氨酸处理的细胞中纯化的细胞质转录物在体外翻译时,由甲基化mRNA产生的DHFR蛋白的量比未处理的mRNA低20%。近期,使用体外翻译以及将报告基因mRNA转染入细胞的研究显示,与未甲基化的转录物相比,腺苷甲基化导致翻译减少。因此,m6A对蛋白质生产的影响似乎在不同的mRNA中是不一致的。

4、影响mRNA的稳定性

 mRNA降解的调节是影响总体细胞mRNA丰度的主要因素。由于在poly(A)尾部中未检测到m6A,因此它可能不涉及聚腺苷酸化依赖性的mRNA降解。Camper SA等人已经通过用STH处理HeLa细胞来检查对mRNA稳定性的影响发现,尽管在高达500μM STH的处理下m6A几乎被完全抑制,但mRNA稳定性没有受到很大的影响。然而,通过高通量测序分析,m6A也富集在3’UTR区域中,3’UTR包含mRNA降解所需的几个重要功能域,如富含AU的元件(ARE),铁反应元件(IRE)和细胞质聚腺苷酸化元件(CPE)。同时,3’UTR是microRNA(miRNA)靶向的区域,因此不能排除m6A参与调控mRNA稳定性的可能性。

5、与microRNA的关联性

MeRIP-Seq数据集的分析揭示了m6A与miRNA结合位点之间的存在着很强的相关性。67%的含有m6A峰的3’UTR也含有至少一个由TargetScan预测的miRNA结合位点。有趣的是,m6A峰和microRNA位点不重叠。通常,m6A峰在终止密码子附近是最丰富的,并且通常沿3’UTR长度推进而水平降低。而microRNA靶位点在3’UTR的末端富集。m6A在3’UTR和miRNA结合位点的存在暗示了mRNA甲基化和microRNA之间的相互作用。确定腺苷甲基化是否有助于microRNA诱导的mRNA沉默作用对于将来的研究是非常重要的。

m6A甲基化检测方法

目前检测m6A所用的技术手段包括高通量测序、比色法以及液相色谱质谱联用(LC-MS)等。高通量测序偏向单碱基水平鉴定m6A;而比色法与LC-MS/MS比较相似,也是从整体水平上检测RNA上m6A甲基化水平。

MeRIP–Seq(m6A RNA immunoprecipitation,或m6A-Seq):首先通过m6A特异性的抗体进行免疫沉淀富集,然后通过高通量测序的方法进行分析,以检测发生m6A修饰的RNA转录本。该方法可将m6A残基定位在100–200 nt的转录本区域中,无法在全转录组水平上鉴定m6A的精确位置。

miCLIP(m6A individual-nucleotide-resolution Cross-Linking and ImmunoPrecipitation):含有m6A的RNA与相应抗体结合以后,通过紫外进行交联,反转录得到的cDNA会出现突变或者截断,这样就可以指示m6A的存在。该方法的分辨率为单核苷酸水平。

选择RNA甲基化作为方向设计课题,可以从哪些方面着手?

总体来看,以RNA甲基化修饰为主题的基金申请还是一个蓝海, 因此如果想选RNA甲基化修饰作为研究方向设计课题,可以从以下四种思路着手:1、研究RNA甲基化修饰过程中的参与者(Writer、Eraser和Reader)分子在疾病或者某一生命过程中的功能。比如:Mettl3介导m6A甲基化修饰调控慢性炎性疼痛机制研究。2、通过MeRIP–Seq/miCLIP等方法首先揭示疾病或者某一生命过程中RNA甲基化修饰的变化,即揭示疾病特异性m6A RNA甲基化图谱。3、揭示疾病或者某一生命过程中某一基因的特定RNA甲基化修饰与疾病的关系。例如,RNA甲基化修饰、基因转录后调控(比如选择性剪接或者翻译,再或者microRNA的产生过程)、基因表达异常、再到疾病或者某一生命过程。4、鉴定参与RNA甲基化修饰的新分子,或者建立研究RNA甲基化修饰的新方法。以上四种思路的研究难度是逐渐增加的,大家如果想选RNA甲基化修饰来作为研究方向,可以考虑逐渐增加难度,其中第4条建立新方法或者鉴定新分子可以说是科学家的工作了。

小编结语

在过去几年中,由于高特异性抗体的可用性和高通量测序技术的可及性,使得鉴定m6A RNA甲基化的化学基础和多种功能成为可能。尤其是m6A IP(交联和免疫沉淀)和RNA-seq技术的快速发展,已证实m6A参与了多种恶性肿瘤的发生发展。这将使与m6A相关酶或m6A依赖途径的靶向成为可能,从而为m6A靶向治疗人类癌症提供重要科学依据。然而,尽管m6A在癌症中的作用已逐渐揭示,但仍存在许多挑战。首先,某些肿瘤中m6A调节因子的机制在很大程度上是未知的,比如虽然很多研究显示,m6A相关调节因子和作用途径可作为癌症治疗中的新的靶点,但缺乏一定的临床实践;其次,m6A甲基化修饰的“Readers”在癌症中的作用和机制仍然是个未知。尽管m6A在许多方面都能影响基因的表达,其副作用也不可忽视。未来的工作旨在深入研究m6A修饰中的“Writers”、“Erasers”和“Readers”参与疾病进程调节的分子机制,结合临床数据评估m6A与疾病的相关性,进一步增强研究者对于肿瘤恶性转化的理解,并助力于设计新的治疗癌症药物。

国自然专题

中国科协发布2020年重大科学问题和工程技术难题

2020-8-15 19:34:22

国自然专题

2020年国自然会评时间表安排 医学部9月中旬开始会评

2020-8-19 18:42:05

加入Q群
0 条回复 A文章作者 M管理员
    暂无讨论,说说你的看法吧
个人中心
今日签到
有新私信 私信列表
搜索