怎样研究一个分子在动脉瘤中的作用

腹主动脉瘤(Abdominal aortic aneurysm,AAA)是一种严重的主动脉疾病,一旦破裂,死亡率很高。因此,需要药物治疗来抑制AAA扩张,并防止动脉瘤破裂。转录因子EB(TFEB)是自噬和溶酶体生物发生的主要调节剂,对维持细胞稳态至关重要。

2020年5月1日, 来自美国辛辛那提大学医学院的Yanbo Fan团队在Circulation上发表了Cyclodextrin Prevents Abdominal Aortic Aneurysm via Activation of Vascular Smooth Muscle Cell TFEB的研究性论文,发现环糊精通过激活TFEB可以防止血管平滑肌凋亡和腹主动脉瘤。HPβCD激活TFEB可能是预防和治疗腹主动脉瘤的潜在治疗方法

1. 材料与方法

1)人主动脉瘤样本:

从密歇根大学心脏外科系获得人胸主动脉瘤样本。人腹主动脉瘤玻片和年龄匹配的对照样品购自Origene。

2)动物研究:

血管平滑肌Tfeb 特异性敲除小鼠:VSMC-Tfeb KO mice,实验使用雄性小鼠诱导腹主动脉瘤。

3)数据获得:

RNA-seq,ChIP-seq和microarray数据已提交到GEO数据库(GSE137577和GSE138000)。

2. 研究内容

1)人和小鼠动脉瘤病变中TFEB减少

首先,研究者对人近端升主动脉瘤病变中的TFEB表达,与相邻的非病变主动脉中的TFEB表达进行比较,发现人胸主动脉瘤病变中TFEB mRNA和蛋白丰度降低。促炎细胞因子(TNFα,IL1β和IFNγ)会引起和加重主动脉瘤,降低了人主动脉平滑肌细胞中的TFEB蛋白水平。同样,TFEB在小鼠腹主动脉瘤病变中,mRNA和蛋白质水平也下调。

2) TFEB 抑制人血管平滑肌细胞凋亡

血管平滑肌减少是主动脉瘤发生的主要特征之一。那么TFEB是否影响血管平滑肌的凋亡呢?在人血管平滑肌上,研究者检测了凋亡标志物。过表达TFEB显著减少PARP,Caspase 3的剪切。与之一致的是,TFEB敲低明显增加它们的剪切活性。进一步,结合碘化丙锭(PI)染色,Annexin V分析法区分凋亡细胞(Annexin V+/PI-)和坏死细胞(Annexin V+/PI+)。TFEB过表达显著减少了凋亡细胞,TFEB敲除增加了凋亡细胞。Caspase抑制剂zvad,消除了由TFEB敲低引起的细胞凋亡,这表明caspase途径在该过程中起着至关重要的作用。 

3) TFEB通过上调BCL2抑制人血管平滑肌细胞凋亡

在过表达和敲低实验中,研究者发现TFEB与BCL2表达直接相关。随后,使用ChIP-Seq和ChIP-qPCR,证明了TFEB与人BCL2启动子的结合。TFEB增加了BCL2启动子驱动的荧光素酶活性,而突变的TFEB结合位点减弱了TFEB依赖性效应。使用BCL2抑制剂ABT199或HA14-1预处理,消除了TFEB在人血管平滑肌细胞中的抗凋亡作用。这表明BCL2在TFEB依赖性抗凋亡作用中起着不可或缺的作用。

4)血管平滑肌特异性敲除Tfeb加重动脉瘤的发展和细胞凋亡

接下来,为了在体确定TFEB对保持血管平滑肌是否同样重要,使用了血管平滑肌特异性敲除Tfeb小鼠(TfebΔSMC),并且构建了多种诱导小鼠腹主动脉的模型。首先,在PCSK9/AngII诱导的腹主动脉小鼠模型中,Tfeb KO小鼠腹主动脉血管平滑肌的最大直径,腹主动脉瘤的发生率明显增加。VSMC-Tfeb KO增加了弹性蛋白的破坏和降解,TUNEL染色显示促进凋亡。

其次,在BAPN/AngII诱导的胸主动脉和腹主动脉小鼠模型中,由于该模型中动脉瘤,及其破裂的发生率很高,因此研究者观察到,VSMC-Tfeb KO显著降低了存活率,还增加了主动脉的凋亡和弹性蛋白降解。

再次,仅通过饮食给予野生型小鼠很少会发生主动脉瘤。但是,在这种情况下,研究者发现,VSMC-Tfeb KO明显增加了腹主动脉的最大直径,而且腹主动脉瘤的发生率和斑块破裂率都增加,且这种增加能在体被凋亡抑制剂(Q-VD-OPh)减少。组织学分析表明,VSMC-Tfeb KO增加了主动脉壁弹性蛋白的破坏和降解,而TUNEL染色显示TfebΔSMC小鼠的主动脉壁凋亡细胞增加。Q-VD-OPh处理也可以挽救体内弹性蛋白的破坏和凋亡。这进一步证明,凋亡是介导腹主动脉形成中VSMC-Tfeb缺乏的不利影响的关键。

5)HPβCD通过消耗细胞内胆固醇激活TFEB,从而抑制平滑肌细胞凋亡 

TFEB激活子诱导TFEB核易位并增强TFEB转录活性,研究者检测了几种TFEB的激活剂,其中只有HPβCD能够抑制血管平滑肌凋亡。进一步检测了用不同剂量(6、8、10 mg / mL)HPβCD处理的血管平滑肌的凋亡,发现HPβCD以剂量依赖性方式抑制细胞凋亡。TFEB敲除消除了HPβCD的抗凋亡作用,表明TFEB在依赖HPβCD的凋亡抑制中起着至关重要的作用。BCL2是血管平滑肌中TFEB的直接靶点。HPβCD在mRNA和蛋白质水平上,均显著增加BCL2,并且TFEB敲除消除了HPβCD对血管平滑肌中BCL2表达的影响。

之前的研究报道,HPβCD能通过加强胆固醇转运移除细胞内的胆固醇,随后抑制mTORC1活性,HPβCD诱导TFEB核转位。为了验证这个假设,检测了HPβCD处理的血管平滑肌中的细胞内胆固醇和mTORC1活性,表明HPβCD降低了细胞内胆固醇,并降低了S6K1和4E-BP1的磷酸化(mTORC1的两个下游效应子)。相反,添加胆固醇会减弱HPβCD抑制mTORC1活性和诱导和转位的能力。同时,还观察到HPβCD增加了TFEB在凝胶中的迁移率,表明TFEB蛋白的翻译后修饰发生了变化。HPβCD降低了TFEB Ser211的磷酸化(抑制TFEB核易位所需的位点)。  

6)HPβCD抑制腹主动脉瘤形成和进展

最后,研究者使用HPβCD来进一步探索TFEB激活对腹主动脉瘤的治疗潜力。在PSCK9/AngII小鼠腹主动脉模型中,HPβCD明显减小腹主动脉和腹主动脉瘤的最大直径,同时减小动脉壁的弹性降解和凋亡。

此外,逆转或阻断主动脉瘤的进展显然具有更高的临床意义。为了解决这个重要问题,PCSK9 / AngII模型的腹主动脉瘤已经形成后,从第5周开始,用HPβCD处理小鼠,结果显示HPβCD显著抑制腹主动脉瘤的进展。

3. 研究思路

4. 研究总结

在本研究中,使用血管平滑肌特异性Tfeb基因敲除小鼠,发现了TFEB在腹中动脉瘤中的保护作用,并阐明了TFEB控制血管平滑肌存活的分子机制。此外,HPβCD是FDA批准的环糊精衍生物,目前可用于提高药物的溶解度,并且在II期临床试验中用于治疗尼曼-皮克病C1型(NPC1)。本文发现HPβCD可激活TFEB, 并在多种小鼠模型中抑制腹主动脉瘤,证明了使用TFEB激活剂治疗腹主动脉瘤的潜力。

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