细胞冻存与复苏技巧

在科幻片中,“人体冻存”一词经常存在,末日来临之际,它就是保留人类火种的最后堡垒。
虽然大部分专家坚持人体冷冻复活只是一种科学幻想,但在细胞的世界中,休眠(冻存)和苏醒(复苏)却是早已得以实现,并且还是anytime。
不过,话说细胞为何一定要进入休眠呢?毕竟,只要能传代,那不就可以子子孙孙无穷匮也么?
其实不然,但凡你和细胞打过交道,就该明白,细胞传代并非万能,传代次数一多,变异迟早要来;更何况,细胞大多身娇体弱脾气暴躁,一言不合就自挂东南枝。
所以,做细胞实验,未雨绸缪才是王道。为避免细胞彻底挂掉,总要在其茁壮成长(对数生长期)的时候,将其一部分送至液氮(-196℃)之中进行长期休眠,方便后续复苏时使用。
那么在这一看似神奇的生命存储过程中,我们不禁要问,这是如何实现的呢?
 
细胞冻存前,应处于指数生长期,确保细胞处于健康状态。理想情况下,应在收获细胞前24小时更换培养基。
建议对培养物进行微生物污染物(特别是支原体)的检测,并通过适当的方法(如STR分析)确定其身份。
如果在培养过程中使用抗生素,那么建议在冷冻前1到2周不使用抗生素,这样如果出现污染,可以更容易地发现。
首先收集细胞。如果细胞是贴壁细胞,那么在倒出培养瓶中原有的培养液后,PBS洗两遍,0.25%胰蛋白酶消化,消化时间根据细胞系决定,一旦通过显微镜发现细胞变圆,则可以加入等量完全培养基终止消化。
用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞,使其成为均匀分散的细胞悬液,将细胞收集于离心管中离心(1000r/min,5min)。如果是悬浮细胞,则直接离心即可。
然后将预先配制好的冻存液(20%血清培养基+10%DMSO)与制备的细胞悬液(5×106~1×107/ml)以1:1的体积混匀。此过程最好放于冰上或4℃,尽量减少细胞常温代谢活动
以每管1ml分装于冻存管中,密封后标记好细胞名称和冻存日期,同时做好登记(日期、细胞种类及代次、冻存支数)。
 

接下来便正式进入细胞冻存阶段,这里有两种方法可供大家选择:
1)程序降温法:冻存管置于4℃ 30 min → -20℃ 30 min → -80℃ 16-18 小时(或过夜)→ 转移至液氮长期储存。
其实,细胞置于4℃及-20℃的时间不必太长,且从4℃转移至-20℃时,最好颠倒混匀下细胞,防止细胞大量沉降堆积至管底,影响细胞复苏;由-80冰箱转移到液氮时速度要快,避免温度上升影响细胞活性。
2)快速降温法:将冻存管转移至细胞冻存盒(冻存盒需要提前预冷至4℃,需检查其内异丙醇或其他液体是否足量)后,放于-80℃冰箱过夜;或置于渐冻仪中以1-2℃/min的降温速率降至-100℃后,再将细胞转移至液氮长期保存。
 

其核心就在于:缓降。因此,也有人将将冻存管捆绑在一起,外层包以厚层棉花,置于-80℃冰箱过夜,然后置于液氮罐中长期保存,这种简易的做法也是可行的。
一般而言,细胞冻存在液氮中可以长期保存,但为妥善起见,冻存半年后,最好取出一只冻存管细胞复苏培养,观察生长情况,然后再继续冻存
那细胞又要如何复苏呢?有语:慢冻速溶,这复苏细胞最重要的就是一个字,则通过快速融化法复苏细胞,就可保证细胞外结晶快速融化,以免慢速融化水分渗入细胞内,再次形成胞内结晶损伤细胞。

从液氮容器中取出冻存管,立即放入37℃水浴箱中快速解冻(1min左右),水面不可没过盖子,以避免污染。
如果冻存管管壁较厚、隔热,而导致水浴时间太长(2min还没融化)时,可以将水浴锅温度调至40℃左右,以缩短解冻时间。
一旦内容物解冻,将冻存管从水浴中取出,浸入或用70%乙醇喷洒。而后将冻存管移至无菌工作台中,打开冻存管,将细胞悬液吸到15ml离心管中,且加入10倍以上培养液,混匀离心(1000rpm,5min),弃上清。
加入10%小牛血清培养液重悬细胞,计数,调整细胞密度,接种培养瓶,置于37度恒温箱中培养即可。
次日更换一次培养液,继续培养。此举一方面可以稀释DMSO的浓度,减少DMSO的细胞毒性,另一方面也可以使细胞缓慢适应培养基的生长环境。
 
另外,复苏细胞时一定要有耐心,因为有些细胞在复苏一星期后才会真正有起色。
 
因而,尽管细胞在复苏三四天后没有任何动静,也不要轻易倒掉所有细胞,要耐心等待,先不要着急换液,试着补加血清、细胞因子,等一周后再看细胞增殖情况再定。
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