蛋白间直接相互作用研究套路

蛋白间相互作用的研究通常为医学基础科研中的难点,因为涉及到蛋白间结合、结合后功能及结合位点验证,相关的实验难度也是非常之高。本次解读的文献于近期发表在《Cancer Cell》杂志(IF=26.6),详细阐述了三元蛋白交互作用在胃癌中的研究思路,并根据结合位点设计了具有治疗作用的小分子多肽,为研究靶向药物提供了依据。整个研究内容详实、逻辑严谨,研究思路不仅仅局限于癌症,可以为大家探索蛋白交互作用及相关临床转化提供思路。

原文链接:
https://doi.org/10.1016/j.ccell.2020.05.019

Hippo信号通路是一条抑制细胞生长的通路,由一系列保守的激酶(MST1/2、LAST1/2)组成,主要通过抑制下游转录共激活因子YAP和TAZ,阻止其入核,进而抑制相关基因(包括CTGF、CYR61等促瘤基因)的表达。

 (图片来源:CST网站)

Hippo信号通路失调在众多癌症发生发展过程中起着重要的作用,包括胃癌。已知MST1/2功能缺失可以导致肿瘤发生,然而在肿瘤中却很少发现MST1/2突变,其中一个原因可能是磷酸酶介导的MST1/2去磷酸化进而使其丧失功能,然而这一过程背后的具体机制及其在肿瘤发生过程中的作用还不完全清楚。本文研究者拟在前期研究基础上,继续探究胃癌中磷酸酶介导MST1/2被抑制的机制,力求重新恢复Hippo通路的抑癌活性,为设计治疗药物提供依据。

研究思路

利用siRNA方法筛选到STRN3是抑制Hippo通路的一个PP2A调节亚基

可逆磷酸化过程是调节Hippo通路功能的关键,因此研究者首先想找到在胃癌发生过程中失活MST1/2的特异性磷酸酶。利用两步siRNA筛选策略,研究者发现了STRN3(磷酸酶PP2A的一个调节亚基)抑制MST1/2的效果最明显。

进一步的实验表明:敲除STRN3能够增强胃癌细胞MST1/2、YAP等基因的磷酸化水平(MST被磷酸化后激活,YAP被磷酸化后失活),对RNA-seq结果进行分析也提示敲除STRN3后YAP相关基因低表达。而且,敲除STRN3能够抑制胃癌细胞生长、增殖,这种抑制效应可被过表达YAP所抵消。

结论:在胃癌细胞中,STRN3是调节Hippo通路肿瘤抑制活性的关键分子。

 Figure 1

STRN3分子致瘤功能的验证

为了进一步明确STRN3在胃癌发生过程中的作用,研究者先对其细胞表达水平进行检测,发现STRN3在胃癌细胞中高表达,且与YAP水平呈正相关,此结果在GEO数据库中也得到了验证。另一方面,对胃癌患者临床资料进行生存分析,发现STRN3高表达者预后较差。

接下来,研究者使用药物诱导的动物模型继续探究STRN3的致瘤效应,实验结果表明:①药物诱导时间越长,STRN3、MST1/2、YAP等蛋白的变化越显著;②敲除STRN3可以抑制肿瘤生长,且敲除越多,抑制效应越明显;③敲除STRN3产生的抑瘤效应可被导入YAP所抵消。

结论:敲除STRN3能够抑制胃癌发生,此效应主要依靠限制原癌基因YAP的活性。

 Figure 2

STRN3通过充当蛋白骨架,促进PP2A对MST1/2的去磷酸化

接下来,研究者旨在探究STRN3和MST1/2之间的具体调控机制。体外pull down实验结果表明:PP2Aa(PP2A的功能亚基)只有在STRN3CC(STRN3盘尾区)存在的情况下才能够与MST2发生相互作用,出现去磷酸化现象,说明STRN3发挥的是蛋白骨架的作用(如示意图Figure 3C)。如果采用结合位点突变的方法扰乱STRN3与PP2Aa的相互作用,则对MST2的去磷酸化作用消失,相应地,也不能够再调控下游基因表达及细胞表型。

 Figure 3

 Figure S4

接下来研究者继续实验,找到了STRN3中与PP2Aa结合的氨基酸序列并命名为STRN3Core。此段区域仅仅可以与PP2Aa结合,并不能招募MST1/2,因此并不能发挥完整长度STRN3的功能,也即STRN3Core不能够引起PP2Aa介导的MST2去磷酸化。基于此种结果,研究者假设:STRN3Core可与全长STRN3竞争性结合PP2Aa,阻止STRN3-PP2A复合体对MST1/2的失活(如示意图Figure 4D)。为了验证此假设,研究者在肿瘤细胞及动物模型中对STRN3Core进行过表达操作,观察到:过表达STRN3Core能干扰STRN3与PP2Aa结合,进而促进Hippo通路的抗肿瘤活性。

 Figure 4

根据以上实验结果设计干扰STRN3-PP2A相互作用的多肽SHAP

基于STRN3Core的抗肿瘤效应,研究者合成了一段模拟STRN3Core的多肽——S3C,并发现其具有与STRN3Core相似的作用模式及效果。进一步对序列进行缩短、优化,研究者找到了具有最佳抑制活性的多肽片段——SHAP,通过实验结果发现:SHAP可以高效阻断STRN3-PP2Aa之间的相互作用,增加MST1/2、YAP磷酸化水平,进而抑制YAP下游基因表达,无论是在细胞还是动物中均能起到抑制肿瘤的作用。

 Figure 5

 Figure 6

研究总结

本文以胃癌中Hippo通路失活为出发点,首先筛选到了关闭此通路抑癌活性的关键分子——STRN3。接下来就是对STRN3分子功能的研究:STRN3能通过对MST1/2的去磷酸化作用,进而失活Hippo通路,使YAP磷酸化水平降低、活性增加,进而促癌相关基因表达增加,促进肿瘤发生,即:STRN3是一个促瘤分子。在明确STRN3的功能之后,即是探究其发挥去磷酸化作用的具体机制:通过充当蛋白骨架,分别结合PP2Aa与MST1/2,促进PP2Aa对MST1/2的去磷酸化作用,并基于此设计了干扰STRN3-PP2Aa结合的小分子多肽SHAP,起到靶向治疗的作用。

从本文中,我们也可以学习到研究蛋白互作(也包括其他分子间相互作用)的基本模式:首先发现新的分子,明确分子功能;在继续研究作用机制时就可以探究其与上下游分子之间的相互作用,然后继续研究这种相互作用所介导的功能表型;如果想要继续深入探究,就可以寻找分子间结合片段或结合位点;最后,就可以根据结合关系设计靶向治疗药物。这种研究模式不仅仅使用于肿瘤研究,大家在学会之后也可以应用到自己所研究的疾病中,从而发表高分文章。

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