慢乙肝患者NAs治疗下的循环HBV RNA主要是全长的pgRNA?

在慢性HBV感染者血清中能够检测到HBV RNA,但目前对这些RNA的具体分子特征仍有争议。我们实验室最早提出HBV RNA病毒样颗粒中的HBV RNA多为未启动或未完成逆转录的pgRNA以及其剪接变异体【1】,并且由于P蛋白的RNase H活性,这些pgRNA的3’端往往是截短的。最近,来自Fabien Zoulim 实验室的Bernd Stadelmayer及其同事采用HBV full-length 5’RACE (rapid amplification of cDNA ends)技术,证实了外泌的HBV RNA病毒样颗粒除了全长的pgRNA外,也有剪接变异体(splicing variants)的存在【2】,这一结果与我们实验室的推测相契合。

作为反映肝组织内cccDNA存在及其转录活性的血清病毒学标志物,我们进而提出HBV RNA可以作为监测核苷(酸)类药物(NAs)治疗下血清HBV DNA检测阴性慢乙肝患者病毒状况的血清病毒学新指标【3,4】。为明确NAs治疗下血清HBV RNA的存在形式,我们实验室曾开展了一系列的研究。首先,我们通过靶向pgRNA 的preC/C区、S区和X区(对应pgRNA 5’端、中段和3’端逆转录起始区)的qPCR检测,对循环血中HBV RNA的形式及其随NAs治疗的变化进行研究,证实了NAs治疗下循环血中的HBV RNA为3’端缺如的pgRNA,并存在高丰度的剪接变异体【5】。继而,在后续实验中我们发现,靶向preC/C区、S区和X区的HBV RNA定量水平依次递减。这样的递减顺序与逆转录合成rcDNA负链过程中作为模板的pgRNA被P蛋白的RNase H活性逐步降解的方向相一致。通过检测preC/C区、S区和X区3个不同区域HBV DNA的水平及其变化的差异,我们从另一个方向印证了上述靶向不同区域的HBV RNA存在差异的事实【6】。进一步,我们讨论了NAs治疗下pgRNA 3’端截短及剪接体变异对靶向不同区域的PCR引物及TaqMan探针设计在循环血中pgRNA定量检测的影响,并建议尽量选择preC区作为检测区域,以尽量避免常见的剪接变异带来定量的不准确性,影响对cccDNA转录活性的判定。

Northern Blot 结果来自参考文献doi: 10.1002/hep.30844;doi:10.1016/j.jhep.2017.10.030,结果C修改自参考文献doi: 10.1128/AAC.00680-17。

下面同学们介绍的Mark Anderson的这篇文章【7】,通过对HBV RNA Core基因区和X基因区双通道TaqMan探针法qPCR检测,定量分析了1827例患者循环血样本中的RNA不同区域水平,并依据两种定量检测所确定的HBV RNA水平相近,推测NAs治疗下血清中HBV RNA的主要组分是全长的前基因组RNA(pgRNA)。然而,对其数据的细致分析发现,在其相当数量的患者样本中,靶向Core区所检测到的HBV RNA总是要比靶向X基因区高数倍之多。这些结果提示:1. 在其检测样本中可能存在因被P蛋白的RNase H活性降解所形成的pgRNA 3’端截短体,以至于靶向X基因区的HBV RNA水平偏低;2. 不排除其Core区的下游引物受NAs治疗下pgRNA剪接变异增加带来的影响,使其与靶向X基因区的HBV RNA水平差异缩小。理论上讲,这种影响会缩小其与X定量的差异,由此得出的 NAs治疗的慢性乙肝患者循环血中存在的HBV RNA主要为全长的pgRNA的推论值得商榷。由于核衣壳的形成需要P蛋白与pgRNA的结合,我们赞同该文的另一观点,即循环血中的HBV RNA少有2.4 kb、2.1 kb(大、中、小HBsAg的mRNA)及0.7 kb(X蛋白的mRNA)等转录本存在。至于另一3.5 kb的preC 转录本(HBeAg的mRNA,与pgRNA一样含有能与P蛋白结合的5’端ɛ结构)何以很少被核衣壳所包裹,是一个非常值得深入研究的课题。 

我们的“片警实验室”公众号近期介绍了牛津大学实验心理学系发展神经心理学教授Dorothy Bishop发表在Nature杂志的一篇名为“How scientist can stop fooling themselves”的文章。文中提到,当我们面对新的数据时,我们都倾向于忽略那些与我们的观点相矛盾的证据,而人性的认知偏见(已存在于我们大脑中的想法)会诱导我们看到那些并不存在的结果。

血清HBV RNA作为新的反映肝组织cccDNA存在及转录活性的新指标,在相当长的时间内人们会对其来源、分子特征及临床意义争议不断。但我们相信,我国新版的《慢性乙型肝炎防治指南》(2019版)将之写入,必将广泛促进对该指标的机制研究和更多临床应用的进一步探索。

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是感染性肝脏疾病的主要病因,并在全球范围内造成了约2.57亿人慢性感染,每年因此死亡的人数达到78.6万。在HBV的复制周期中,位于感染细胞细胞核内的病毒共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)转录成多种mRNA,其中就包括了全长(超过病毒基因组)的前基因组RNA(pregenomic RNA, pgRNA)。pgRNA被包裹进由病毒核心蛋白组装的衣壳中,并在病毒HBV DNA聚合酶(polymerase,P蛋白)作用下反转录为rcDNA。最近,已经有多篇文献表明慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者血清中除了HBV DNA外,还可以检测到pgRNA。在未经治疗的患者中,pgRNA水平约比HBV DNA水平低1.7±0.71 log左右。长期的核苷(酸)类药物(nucleos(t)ide analogues,NA)抗病毒治疗是CHB患者治疗方案之一,其药物包括有恩替卡韦(entecavir)、替诺福韦(tenofovir)等。核苷(酸)类药物(NA)作用于病毒的反转录过程,能够显著降低血清病毒DNA载量。但是NA不能直接影响cccDNA的稳定性或转录活性,也不能阻断pgRNA病毒样颗粒的包装和分泌,因此NA治疗的CHB患者常带有高水平的pgRNA,这反映出患者肝组织中cccDNA仍处于转录活跃状态。

有学者提出将患者血清pgRNA定量作为监测cccDNA功能状态的非侵入性手段,并用于监测NA治疗效果。为此,文章作者的前期研究报道了一种双荧光通道qPCR方法用于同时定量检测HBV感染患者血清中HBV Core基因区和X基因区的RNA水平。他们的研究结果显示,该方法在无论有无NA治疗的急性和慢性乙型肝炎患者血清pgRNA检测中均表现出了极佳的检测效果,且Core基因区和X基因区定量水平表现出了极高的一致性。目前,在血清中观察到的HBV RNA类型还包括HBV RNA剪接变异体,X基因mRNA以及其它种类HBV RNA等,这提示含HBV RNA的病毒颗粒中可能包含复杂多样的RNA。这让作者提出这样一个问题,在其开展的pgRNA研究中是否有各种HBV RNA变异体存在。在该文中,通过双荧光通道方法,作者检测了一个更大的NA治疗的CHB患者队列中pgRNA的Core基因区和X基因区RNA水平,来尝试回答这个问题。

结果

通过对684名患者(共1827例样本)的基线及NA治疗不同时间点纵向队列血清中的981例RNA水平处于定量线性范围之内的样本进行Core基因区和X基因区(引物靶点见图1A)的RNA水平定量检测结果显示,Core区RNA水平处于1.81-8.91 log₁₀ U/mL之间,X区RNA水平处于1.67-8.54 log₁₀ U/mL之间,相关性分析显示二者之间具有很强的线性关系 (R² = 0.960)。由于所测两个靶点的HBV RNA水平相似,作者认为该结果提示检测到的血清HBV RNA为全长的pgRNA(图1B)。Bland-Altman分析(常用于评价连续变量的一致性也表明Core区和X区RNA水平具有良好的一致性(95%置信区间介于-0.517至0.889 log₁₀ U/mL,Core区偏倚值为0.19 log₁₀ U/mL)(图1C)。

在这981例样本中,有22例样本Core区和X区RNA水平差异大于±1 log₁₀ U/mL。对其中15例血样足够的样本,用原始引物及一对额外的Core区引物对这些样品进行重新检测时发现,其中 9份(60%)不再有Core区和X区RNA水平差异大于±1 log₁₀ U/mL,这说明观察到的差异可能是由仪器运行误差或者Core区基因突变造成的(图1D&E)。在Core区和X区RNA水平差异仍然大于±1 log₁₀ U/mL的6例样本中,有3例来自同一位个患者,提示Core区基因突变会影响引物与模板的结合(注:文中未见相关突变检测信息)。其余3例样本的X区RNA始终处于较低水平,这提示突变影响了X区引物与模板结合。纳入复测样本后,981例NA治疗患者样本中有968例(98.7%)的Core区和X区RNA水平差异小于±1 log₁₀ U/mL,这说明患者血清中检测到的RNA主要为全长的pgRNA。

图1 慢乙肝患者血清HBV Core区和X区RNA定量水平的比较。

总结

该研究提供了一个NA治疗下的大型CHB患者队列的Core基因区和X基因区定量数据。既往研究中报道,HBV衣壳内的RNA主要为全长pgRNA,几乎没有检测到短于pgRNA的其他种类RNA。这与之前的报道的通过数字PCR证实的血清中全长pgRNA水平为precore RNA的200倍以上的结果相一致。然而新近的研究提示,在CHB患者的血清中,除了pgRNA外,还有 HBV RNA剪接变异体,编码HBx蛋白的mRNA以及更小的RNA片段的存在。此文通过对pgRNA检测进行设计,分别针对pgRNA两端的Core基因区和X基因区进行检测,如果在血清HBV RNA中有其他种类的RNA占据了较高的比例,那么Core基因区和X基因区的定量结果应当有较大差异。然而,即使在接近定量检测下限的范围,Core和X的定量结果仍然表现出了极强的一致性。如果剪接变异体和X基因mRNA大量存在,那么检测结果应当表现出极强的Core区或X区RNA水平偏倚。然而Bland-Altman分析结果显示仅有极小的向Core区RNA水平偏倚,而作者认为这种偏倚可以通过引物的扩增效率差异来解释。值得注意的是,队列中的样本没有涵盖肝细胞癌患者(既往报道认为肝细胞癌患者血清存在高水平HBV RNA剪接变异体)。另外,在作者的结果中,HBeAg的状态对Core区和X区的定量也不存在影响。这些结果提示全长pgRNA在血清HBV RNA中占据主要地位。由于没有观察到Core区或X区RNA水平的明显偏倚,作者认为非pgRNA不可能在血清中以高水平存在。未来定量分析血清中可检测的其它种类HBV RNA与全长pgRNA的相对数量的研究将具有很大的意义。

【1】 王杰,等. J Hepatol. doi:10.1016/j.jhep.2016.05.029.

【2】  J Hepatol.doi:10.1016/j.jhep.2020.01.028.

【3】 鲁凤民,等.2016. doi:10.3760/cma.j.issn.1007-3418.2016.09.001.

【4】 鲁凤民,等.2016.doi:10.3760/cma.j.issn.1007-3418. 2017.02.005.

【5】 王杰,等. J Hepatol. doi:10.1016/j.jhep.2017.10.030.(与窦晓光教授团队合作)

【6】 刘永振,刘慧,等. Hepatology. 2020 doi: 10.1002/hep.30844.(与魏来、郭巨涛等教授团队合作)

【7】 Clin Infect Dis. 2020 Jul 20;ciaa1015. doi: 10.1093/cid/ciaa1015.

文献来源:

Anderson M, Gersch J, Luk KC, et al. Circulating Pregenomic HBV RNA is Primarily Full-length in Chronic Hepatitis B Patients Undergoing Nucleos(t)ide Analogue Therapy [published online ahead of print, 2020 Jul 20]. Clin Infect Dis. 2020;ciaa1015. doi:10.1093/cid/ciaa1015

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