SnapGene教程指南

SnapGene教程指南

分子克隆是做分子生物学最基本最基本的实验操作 SnapGene是一款综合性的分子生物学的软件,其包括的功能如PCR,酶切,质粒,载体构建,电泳等等,基本上你用到的,这里都有。

基本很多的分子克隆相关的软件都可以用SnapGene替代,如Vecter NTI, DNAstar, DNASIS等等。

起始界面如下:

这款软件用来绘制图谱,编辑序列,设计引物,重组克隆都非常方便。对于克隆,在软件的Actions工具栏内除了常规的限制性酶切插入克隆 ,PCR等常规操作,还列出了5种成熟的商业化的无缝克隆供使用者选择。这5种克隆技术分别是:

Gateway Cloning(门途径克隆) 可以模拟BP和LR反应,从而确保构建出的载体有正确的开放阅读框。Gibson Assembly(吉布森无缝克隆) NEBuilder HiFi DNA Assembly(NEB高保真DNA组装) PCR模拟 In-Fusion Cloning(In-Fusion无缝克隆) TA or GC Cloning(TA克隆GC克隆)

分子生物学的基础—PCR

PCR原理 PCR是所有分子生物学实验的基础,全称为聚合酶链式反应,通过高温变性,退火和延伸反应三部曲来扩增目的DNA序列。通过引物的设计变化,扩增反应的组合,特殊酶的使用等等,基础的PCR反应可以有千万种变化。下面介绍两种在克隆构建中经常会被用到的PCR方法。

重叠延伸PCR

如图所示,重叠延伸PCR中的“重叠”指的就是两组PCR的产物,通过引物引入一段相同的序列。这段相同的序列,使得两组PCR产物的单链能够在退火时结合,这种杂交产物在DNA聚合酶的帮助下延伸成完整的DNA双链。再通过最两端的引物对融合的长片段DNA进行扩增。

需要注意的是,引物设计时引入的“重叠”序列是反向互补配对的。重叠延伸PCR可以将两段DNA序列进行融合,通过这种方法可以构建融合基因,也可以用来将无法一次获得全长的DNA序列,通过分段扩增,再拼接的方法获得。此外,如果“重叠”序列也可以经过特殊设计,来引入一段插入序列,如酶切位点等。

通过PCR来制造突变

用PCR来造突变

由于引物与模版不完全互补配对并不影响延伸,所以用PCR引入突变主要是在引物上“做手脚”。(但注意,引物3‘末端的碱基必须互补配对!)

在引物上添加一段序列即可获得插入突变。这时候需要注意,对于表达序列,插入碱基的数目一定要是三的倍数,否则会造成阅读框移码。在引物上替换几个碱基也可以引入突变,一般用于表达产物的氨基酸突变。此外,还需要提防改造后的引物匹配到模版中的其它位置。这里可以提前用blast预测看看。

 

限制性酶切和连接

限制性酶切和连接是最常见的载体构建方法。利用限制性内切酶对DNA序列和载体质粒进行酶切,暴露出相同的黏性末端或者平末端,再利用DNA连接酶(一般是T4 ligase)进行连接。!限制性酶切和连接

无缝克隆

由于限制性酶切和连接的方法依赖限制性内切酶的使用,构建成功与否取决于目的DNA和载体序列上是否存在合适的酶切位点以及对应的酶。因此开发出无缝克隆的技术,不依赖限制性内切酶,使得克隆更加便捷,应用范围更广。

Gateway Cloning

Gateway Cloning,翻译成门途径克隆,是由invitrogen公司研发的技术,目前经过多轮收购,属于Thermo公司。Gateway的核心是利用λ噬菌体位点同源重组。

Gateway cloning 目的基因和载体基因ccdB的序列两段带有att X序列,这个att X可以看作是同源重组的“信号序列”,分为”att B”、”att P”、”att L”、”att R”四种。其中”att B”和”att P”通过BP重组酶进行交换(BP反应);其中”att L”和”att R”通过LR重组酶进行交换(LR反应)。目的基因首先通过与供体质粒(Donor vector)进行BP反应,获得含有目的基因序列的克隆载体,算是“入门”。随后可以与多种目的载体进行LR反应,将目的基因置换到目的载体当中。ccd B是一种致死性基因,载体上表达ccd B时,感受态细胞无法存活,由此来清除Gateway cloning过程中的副产物。

Gibson Assembly

吉布森无缝克隆是JCVI研究所的“吉布森”教授(Daniel G. Gibson)发明,利用DNA同源重组原理,比GAteway cloning更加简单,应用非常广泛,基本上各大公司都有相应的产品。

Gibson Assembly 首先目的DNA和载体两段需要有15bp的同源序列。由于这段序列可以源自载体序列,通过PCR加到目的序列上,所以实际获得的拼接是无缝的。然后通过5‘外切酶的目的序列和载体都暴露出单链DNA,形成类似于黏性末端的单链接头,退火使目的序列和载体互补配对,利用DNA聚合酶补齐末端缺失的碱基,再用DNA连接酶“缝合”切口,从而完成克隆。看似用到多个酶的多步反应,通过混合酶或重组酶也可以Mix的体系,进行一步操作。

In-Fusion Cloning

In-Fusion cloning是由clontech公司开发的,其原理与Gibson cloning大体相同,主要区别也是在于使用的酶,也属于专利产品。

In-Fusion cloning

NEBuilder HiFi DNA Assembly

NEB公司的高保真DNA组装与Gibson cloning的原理类似,使用的就是经过改造的重组酶,为其公司的专利产品。可以用一步反应进行DNA组装。它的特色还在于反应中使用的酶的高保真性。

NEBuilder HiFi DNA Assembly NEB公司自己就拥有上述三种克隆方法对应的产品。

TA or GC Cloning

TA克隆和GC克隆是最简单,也是最“小学生”的克隆。TA克隆利用Tag酶在PCR产物3‘末端加A的特性,设计对应5‘末端加T的载体与之配对。这样PCR的产物不用经过任何处理就可以与载体进行连接,一步完成。GC克隆与之相同,是利用了另一种DNA聚合酶3’末端加G的原理,当然目前这种酶用得越来越少了,几乎是停产,所以一般没人使用了。

工具介绍

FusionGDB:融合基因功能预测数据库

2020-8-17 18:35:08

工具介绍

刘小乐教授实验室开发过的网站和软件

2020-8-20 18:24:44

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