文献解读:lncRNA-蛋白的互作关系研究思路

西方有这样一句老话,通过一个人的朋友就可以判断他的为人,这句话同样适用于生物分子。如果你想知道某个生物分子的功能,可以从与它相互作用的分子入手。

lncRNA红火至今,也是因为它与DNA、RNA、蛋白质均有着千丝万缕的关系。其中,lncRNA-蛋白的互作关系更是成为了科研者们聚焦的热点。

如今就分享一篇发表于Oncogene(IF=7.971)的lncRNA-蛋白互作文章,让我们一起围观高手怎么戏耍lncRNA小怪物的。

题目四要素

主变量:NORAD(lnc RNA)

因变量:上游YAP pathway(YAP / TAZ-TEAD复合物),下游效应变量S100P(蛋白)

疾病:肺癌、乳腺癌

表型:转移

结合摘要做出科学假设:在肺癌、乳腺癌中,YAP抑制NORAD,后者通过结合S100P抑制肿瘤转移。

 

假设逻辑

1. 表达差异:临床样本检测肿瘤患者与对照组NORAD表达水平

2. 正反回复:上调、下调NORAD,NORAD与S100P反反反/反正正回复,观察表型

3. 细胞动物:in vitro & in vivo

4. 分子交互:主变量NORAD与S100P的直接作用机制

 

数据解构

Fig1:NORAD expression in lung and breast cancer patients and the correlation of NORAD expression with prognosis

1A、B:肺癌、乳癌中NORAD的表达

1C:NORAD在配对非肿瘤-肿瘤肺组织中的表达

1D、E:KM生存曲线评估NORAD表达与肺癌和乳癌患者生存率的关系

1f、g:肺癌和乳癌中NORAD表达与淋巴结转移的关系

总结:肺癌、乳癌中NORAD低表达,与淋巴结转移和低生存时间相关

Fig2:NORAD is repressed by the YAP/TAZ pathway

(1)探索NORAD低表达的机制:UCSC Genome Browser发现TEAD4调节NORAD的5’结构区;

2A:shRNA、siRNA干扰TEAD1/3/可增加NORAD的表达;

2B:敲减TEAD1/3/可增加NORAD的表达

2C、D:P17和维替泊芬干扰TEAD与YAP/TAZ的结合也可同样增加NORAD的表达

2E-G:同时降低YAP和TAZ可增强NORAD表达和NORAD启动子活性

(2)NORAD是否是YAP/TAZ-TEAD的直接靶标:PROMO program预测了6个可能的TEAD4与NORAD启动子结合位点;

2G-I:片段分析定位直接结合位点

2J、K:ChIP确认TEAD4被招募到NORAD启动子中,YAP/TAZ和NuRD复合体的组件(CHD4、MTA1)均被募集到NORAD启动子的同一区域,TEAD1 / 3/4敲减可取消招募

总结:loss of function 论证上游因变量与主变量调控关系;片段分析与ChIP验证结合位点

Fig3:NORAD suppresses migration and invasion and its downregulation contributes to the migration and invasion effects of the YAP pathway. 

3A:RT-qPCR检测NORAD基础表达

3B、C:NORAD过表达降低CL1-5的迁移和侵袭能力,NORAD低表达促进CL1 – 1的迁移和侵袭、示shRNA干扰NORAD表达的效率

3D、E:YAP 8SA转染检测CL1-5、Hs578细胞系转移和侵袭能力

3F:TAZ shRNA, YAP shRNA,  NORAD shRNA干扰的H460细胞系转移和侵袭能力

总结:主变量NORAD、上游因变量YAP/TAZ与表型调控的一正一反论证、主变量与上游因变量的反反反回复验证

Fig4:NORAD binds S100P through its multiple repeated units.

4A:RNA-pulldown,孵育过表达的GFP-S100P的293T细胞裂解液与生物素化NORAD片段、反义RNA,

4B:RNA-pulldown,孵育细菌纯化的GST-S100P或GST与生物素化的NORAD U7片段、反义RNA

4C-E:RNA-pulldown,孵育细菌纯化的GST-S100P与各种生物素化的NORAD片段

4F、G:RIP,检测H460和ZR75细胞系中S100P抗体或对照IgG回收的靶RNA

总结:RNA pulldown、RIP检测细胞内NORAD与S100P的直接结合位点

Fig5:NORAD antagonizes S100P.

5A、B:H100和ZR75稳定株中S100P与IQGAP1和p53结合的免疫沉淀分析

5C、E:WB检测H460、MDA-MB-231细胞系Cathepsin D、Cofilin P、Cofilin、GAPDH蛋白表达

5D:免疫沉淀分析MDA-MB-231稳定株中S100P与IQGAP1、p53的结合

总结:主变量与下游因变量S100P的一正一反调控关系

Fig6:S100P mediates the effects of YAP/NORAD axis on migration and invasion.

6A:表达NORAD shRNA、S100P shRNA的H460细胞的迁移和侵袭能力

6B:表达NORAD、S100P的CL1-5细胞的迁移和侵袭能力

6C:H460 v.s 敲除S100P、表达NORAD shRNA 的H460细胞系迁移和侵袭能力

6D:瞬时转染YAP 8SA的H460细胞系v.s 敲除S100P的H460细胞系的迁移和侵袭能力6e:瞬时转染野生型和突变型mini-NORAD的H460细胞的迁移和侵袭能力

总结:反反反Rescue验证NORAD与S100P调控关系的必要性

Fig7:S100P sequestration mediates the suppressive effect of NORAD on lung and breast cancer metastasis.

7A、 C:生物荧光示NORAD、S100P与shNORAD、shS100P肺转移

7B、D:第35、42天的肺转移和肺组织切片,散点图计数肺表面转移性结节数目

总结:动物模型验证NORAD与S100P对转移表型的作用

Fig8:YAP / TAZ-TEAD复合物与NuRD复合物一起抑制NORAD转录的模式图以及NORAD在结合S100P以抑制肿瘤转移中的功能

总结:正常细胞中NORAD表达,抑制转移;肿瘤细胞中YAP / TAZ-TEAD复合物与NuRD复合物抑制NORAD转录,促进转移

套路总结

 单变量论证:NORAD→细胞转移、侵袭

1. 表达差异:组织(Fig1)

2. 正反回复:一正一反(Fig3)

3. 细胞动物:动物维度含下游机制验证(Fig7)

 调控关系论证:YAP/TAZ→NORAD、NORAD→S100P

1. YAP/TAZ调控NORAD:直接位点&正反调控(Fig2)、Rescue(Fig3)

2. NORAD-表型:(Fig3)

3. YAP/TAZ-表型:(Fig3)

4. NORAD调控S100P:直接位点&正反调控(Fig4、5)、Rescue(Fig6)

 二元交互论证:YAP/TAZ→NORAD 、NORAD-S100P(RNA-蛋白交互)

1. 筛未知:1)由已知的NORAD通过 UCSC Genome Browser寻找到上游YAP/TAZ-TEAD complex;2)GO富集分析NORAD互作蛋白,选择促转移的S100P

2. 有结合:1)证实NORAD与TEAD1/3/4有结合:shRNA、siRNA、luciferase reporter、P17、维替泊芬多种手段验证;2)证实NORAD与S100P有结合:RNA pulldown 实验

3. 有区域:1)PROMO program预测TEAD与NORAD的结合位点,分段验证+ChIP;2)分段验证+位点突变+RIP确定NORAD与S100P的结合位点

4. 下游效应:1)TEAD与NORAD启动子结合并募集YAP / TAZ和NuRD复合体以抑制NORAD转录;2)NORAD过表达抑制S100P的促肿瘤效应

知识点总结:1.NORAD在肺癌、乳癌中低表达,与淋巴结转移和不良预后相关

2. YAP/TAZ促进肿瘤效应,明星Hippo通路YAP/TAZ-TEAD复合物与NuRD复合物结合,在转录水平抑制NORAD表达;后者作为多价结合平台结合促转移蛋白S100P,抑制转移

3.S100P,S100钙结合蛋白家族一员,在多种癌系高表达,与不良预后相关;S100P通过控制肌动蛋白细胞骨架动力学和细胞外基质重塑调控靶蛋白,包括IQGAP1、Ezrin、肌球蛋白IIA、组织蛋白酶D和磷酸化的cofilin;S100P还可通过结合和灭活p53来增强化疗耐药性

文章评析

图表按照套路进行归类后,我们从创新维度、逻辑维度、数据维度来评析一下这篇文章。

1.创新维度:主变量NORAD并非全新发现,Pubmed可检索到100+条目,与肿瘤的增殖表型也并非首次提出;但与上游YAP、下游S100P均为全新发现,且一口气证明了直接作用位点。

2.逻辑维度:本篇文章为如假包换的三元变量(围绕主变量的上下游),两组两两交互论证采用数据库预测位点+实验验证策略,工作量到位。

3.数据维度:挖掘TCGAGEO数据库作为临床数据来源,细胞动物实验具备, 补充图表丰富.

原文链接:https://www.nature.com/articles/s41388-019-0812-8#Fig2

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