免疫染色杂谈

最近很多次聊到免疫染色,组化和荧光,两个是差不多的实验,只是最后呈现的方式不一样。所以一般能做组化的抗体,也是可以做荧光的。组化,我们一般只染一个靶标,通常用HRP(髓过氧化物酶)显色,呈现通常是棕色,然后再用苏木精染核。除了棕色,市面上卖的还有玫红色、蓝色;除了HRP,用DAP显色之外,还有碱性磷酸酶显色,BCIP/NBT显色试剂盒。有不同的化学反应,还有不同的呈色,但是组化,一般也是只染一个靶标的,用两个反应的很少,染两个靶标的条件,需要靶标在不同位置,比如一个核一个膜,可以染2色(苏木精染核不算)。这是为什么呢?因为两种颜色同时呈现,显微镜是很难分辨的,而且有免疫荧光更直观的方式呀。

那什么时候用免疫组化什么时候用荧光呢?如果你只染一个靶标,用组化就足够,不要荧光,为什么呢?因为组化染色更清晰,而荧光很容易有非特异性染色,而且不好区分真假;有的组织还有自发荧光;还有一个原因是组化容易保存,染好了,室温可以放很久,随时拿出来看,而荧光容易淬灭,拍几次信号就弱了,更别说长期保存。如果共染多个靶标,就必须用到荧光,那荧光最多可以染多少个颜色,看显微镜的激发通道有多少,荧光染料有多少种。现在文章里染六七色的是有的,你要问了,这是如何染出来的呢?

一抗我们常用的种属来源,rabbit、mouse,还有少数rat,对应二抗的种属来源一般也是rabbit、mouse、rat,一抗和二抗肯定要用相同的种属。市面上常用的最便宜的荧光二抗都是直接偶联荧光素的,染了一抗,直接染同种属二抗,DAPI染核,显微镜观察就好。这种情况下,染一个靶标,很容易,随便选一抗。如果要染2个靶标了,最便宜的方法就是买一抗种属不同的,两个可以一起染,再用不同种属的二抗,完全没有问题。如果两个一抗种属相同,用最普通的方法是没法染的,你不要想当然的多洗洗,染完一个,洗个几小时再去染另一个,都是洗不干净的,总有一点点的残留,最后分不清荧光呈现的哪个信号。那如果你的一抗种属相同,怎么办?

这就可以回答上面,好多色是怎么染出来的,当然是有试剂盒了,现在国外公司有卖这种试剂盒,它们的原理就是试剂盒的荧光耐热,染完一个荧光,用热修复方法,修复下一个一抗,热修复可以把残余的二抗煮变性(这种试剂盒二抗和荧光素是分开的),就是染一个抗体加热修复抗原,孵一抗、二抗、荧光素,染第二个抗体,再来一遍,加热修复抗原,孵一抗、二抗、荧光素。所以你可以染很多个靶标,而且这个试剂盒也解决了不同抗原修复方法不一样的问题,这个试剂盒如果你染很多色,要花好几天,所以最好你的抗体都比较好染。这个试剂盒这么万能,没错,价格不菲,我为了克服同一个种属的问题,买了2个荧光素,9千多,平均一个荧光素要5千块,而且量比较少,这个价格都赶上新买两个不同种属的一抗了,但是当买不到不同种属的,还要染2色的时候,只能花钱了。像文章中六七色的,一个试剂盒就要花3万多块钱了,这个钱,还不如买流式抗体,要不想想如何用流式的方法来替代了。

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