非编码RNA“干湿结合”研究思路

在上一回我们看了一篇使用在线数据库结合湿实验最后“危险”地跨过5分的文章,然而有学员跟我说5分区域依旧觉得不过瘾,希望能再来一篇5.5+的文章领悟下“干湿结合”套路。好的没问题,满足你们!上一篇文章涉及到了非编码RNA——miRNA,这次我们一样来看一篇非编码RNA为主变量的文章。

先看题目

这是一篇发表在Cell Proliferation上的文章,最新影响因子为5.753:

我们先一起看一下题目:LncRNA NEAT1 promotes the tumorigenesis of colorectal cancer by sponging miR‐193a‐3p,LncRNA NEAT1通过miR-193a-3p 海绵作用促进大肠癌的发生。我们来拆解下题目,疾病是colorectal cancer,主变量是LncRNA NEAT1,表型是tumorigenesis,次变量是miR‐193a‐3p。

先说一下什么是miRNA海绵作用,简单理解就是miRNA的inhibitor抑制剂,这里我们可以猜测是LncRNA NEAT1发挥了miRNA海绵作用结合miR-193a-3p,影响了miR-193a-3p对下游癌基因的抑制作用,促进了大肠癌的发生,也就是一个ceRNA的套路。我们可以大概猜一下会有哪些内容,完整的一套内容应该是这样:

1:LncRNA在肿瘤中高表达(表达差异,生信分析)

2:LncRNA的研究价值(表型相关,预后相关,生信分析+实验)

3:找下游miRNA(数据库预测+实验)

4:LncRNA上下调检测编码基因表达(实验)

5:miRNA抑制LncRNA和编码基因(实验)

6:Rescue设计:分别进行主变量和次变量的rescue实验(实验)

7:RIP:过表达LncRNA后进行RNA免疫共沉淀(实验)

但是,考虑到这个文章是一个5.5分的文章,并且题目并不涉及到下游编码基因mRNA,所以上面这一套结果中涉及mRNA部分可以不做,直接机制的RIP部分也可以没有。我们先猜测到这里,接下来看看文章。

拆解内容

Figure 1

Figure 1:LncRNA NEAT1在CRC组织中表达上调,并与较差的生存和复发有关

1A图和1B图做的是差异分析的内容,使用TCGA的数据对NEAT1进行差异表达分析,结果发现NEAT1在CRC组织中表达更高,1C图作者联合TCGA中NEAT1的表达数据和预后数据,使用截断法找到高低表达组的最佳cut-off值,并且以这个cut-off值进行生存分析,得到1D图和1E图(一般我们做生存分析会使用中位值,这里使用生信算法找到cut-off值是另一种方法)。结果发现, NEAT1高表达的大肠癌患者的生存期更短,肿瘤复发率更高,并且早、晚期NEAT1高表达患者生存期均较短。

对于LncRNA的研究,LncRNA丰度高是一个前提条件,表达差异必不可少,而检测预后也能直接将分子的研究价值往临床上面靠,使用数据库的优势在于性价比高,即使你不会代码,也能使用各种生信在线工具进行分析,简单方便快捷。

Figure 2

▲ Figure 2:NEAT1促进CRC癌细胞生长

作者认为NEAT1在大肠癌组织中的表达增加,提示其在大肠癌中具有促癌作用,接下来作者就做了一系列的表型实验。先使用qRT-PCR 检测NEAT1在不同CRC细胞系中的表达(2A),发现NEAT1在SW480细胞系中的表达低于正常结肠组织,而在LOVO和HCT116细胞系中的表达高于正常结肠组织,那么接下来就使用SW480、LOVO和HCT116三个细胞系进行研究,在高表达细胞系中进行敲低,在低表达细胞系中进行过表达(2B),进一步分析发现,NEAT1基因敲除降低了LOVO和HCT116细胞系的细胞存活率(2C),而在SW480细胞中过表达NEAT1起到了促进细胞增殖的作用(2D)。对LOVO和HCT116进行sh-NEAT1转染,发现细胞集落形成数明显低于空载体,而过表达NEAT1则增加了SW480细胞的集落形成数(2E和2F)。

Figure 3

Figure 3:LncRNA NEAT1促进CRC细胞的侵袭

Figure 3还是表型实验,这回是侵袭(还记得在干湿结合第一篇推文说的表型“三件套”吗?)。为了观察NEAT1对CRC细胞侵袭能力的影响,作者进行了Transwell实验,结果显示NEAT1基因的敲除减弱了LOVO和HCT116细胞的侵袭能力,而在SW480细胞中过表达则促进了这些作用(3A)。接着又是一个表型——EMT,作者使用Western blotting检测EMT上皮-间充质转化的标志物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的蛋白表达,发现NEAT1基因敲除后,LOVO和HCT116细胞中E-cadherin的蛋白表达增加,N-cadherin和Vimentin的表达降低。反之,NEAT1过表达降低了SW480细胞株E-cadherin的表达,而增加了N-cadherin和Vimentin的表达(3B)。

Figure 4

▲ Figure 4:在大肠癌细胞中,lncRNA NEAT1作为miR-193a的海绵

前面作者一通分析找到了NEAT1的研究价值,又进行了平行表型实验,到了这里,才开始了文章最重要的部分——NEAT1结合miR-193a。要证明NEAT1可以结合miRNA,首先应该找到miRNA,作者使用starbase和miRcode两个数据库预测NEAT1的靶标miRNA,结果发现刚好只有2个(数据库那么多,为什么只选这两个呢?你懂的),作者接着要从2个miRNA中找到确定的那一个靶分子,如果NEAT1发挥了miRNA海绵功能,那么NEAT1和靶分子之间应该是负相关,所以作者接着对两个靶分子进行表达检测,并且与NEAT1表达量进行了相关性分析,结果发现,大肠癌组织中miR-193a表达下调,miR-107表达上调(4B),NEAT1与miR-193a表达呈负相关,与miR-107表达无相关性(4C)。此外,NEAT1降低miR-193a的表达(4D),那接着要做什么呢?找结合位点对吧?所以4E就是miR-193a与野生型(Wt)或突变型(Mut)NEAT1的结合位点。找位点还不够,得验证啊,为了进一步证实NEAT1是miR-193a的靶点,作者进行了luciferase实验,结果表明miR-193a mimic降低了WT NEAT1的荧光素酶活性(4F),作者这里还来了一个给文章加分的实验——在LOVO和HCT116细胞系中进行了RIP实验,使用抗Ago2抗体进行免疫沉淀后,NEAT1和miR-193a都富集增加(4G)

Figure 5

▲ Figure 5:在CRC中,NEAT1基因敲除可抵消miR-193a抑制剂的促瘤作用

这个图展示的是Rescue实验,NEAT1发挥miR-193a的海绵作用,那么rescue的设计应该是敲低NEAT1的同时抑制miR-193a。作者将miR-193a抑制剂和sh-NEAT1共转染到LOVO和HCT116细胞,结果表明miR-193a抑制剂促进了细胞增殖和侵袭能力,而敲低NEAT1则抵消了miR-193a抑制剂诱导的促肿瘤作用(5A,5B),这里Rescue只做了敲低。上游的lncRNA-miRNA做完了,下面还需要做什么?往下游找那就是编码基因mRNA,作者发现以往研究表明IL17RD是miR-193a的直接靶点,并且TargetScan也预测到IL17RD和miR-193a的结合,因此在本文中,miRNA-mRNA部分并不算创新,这时候可以直接做mRNA的rescue实验,证明NEAT1和miR-193a之间的依赖关系。那作者是不是这么做呢?作者先利用TCGA数据分析了IL17RD在CRC中的表达,结果发现IL17RD在大肠癌中的表达明显上调(5C),并与miR-193a在CRC中的表达呈负相关(5D)。为了揭示NEAT1与IL17RD的直接关系,作者将shNEAT1转染LOVO和HCT116大肠癌细胞系,并将NEAT1过表达载体转染SW480细胞系,qRT-PCR和Western blot分析(5E)显示,敲低NEAT1下调了IL17RD的表达。同时,作者做了miR-193a抑制剂与sh-NEAT1共转染对IL1RD表达的影响,发现miR-193a抑制剂可上调IL17RD的表达,而NEAT1基因的敲除可减弱miR-193a抑制剂诱导的IL1RD表达的增加。(有没感觉哪里怪怪的?)

Figure 6

▲ Figure 6:敲低NEAT1对异种移植瘤生长的抑制作用

接下来作者来了一个动物实验,在体外研究了NEAT1对CRC细胞的促瘤作用后,进一步检测了它在体内的作用。作者建立皮下移植瘤模型,观察NEAT1敲除对肿瘤生长活性的影响,结果发现NEAT1基因敲除降低了肿瘤的增殖率(6A,6B),sh-NEAT1组的平均体积和重量均较sh-NC组减小(6C,6D)。从sh-NEAT1组和sh-NC组的肿瘤组织中提取RNA和蛋白质,qRT-PCR检测NEAT1和miR-193a的表达水平,Western blot检测PCNA的表达水平,结果表明sh-NEAT1组与sh-NC组相比,NEAT1的表达降低(6E),miR-193a的表达增加(6F),这表明NEAT1基因的敲除下调了PCNA在肿瘤组织中的表达。(PCNA是肿瘤增殖表型的marker)

小结

这样,整个文章就全部结束啦!相比较前面的干湿结合文章,这个文章更加符合我心目中干湿结合文章的样子,生信分析与实验相结合,整个文章环环相扣,细胞、组织、动物、生信四个维度齐全,多角度全方位对文章观点进行论证,RIP实验和Rescue实验是文章能够上5分的一个关键,然而美中不足的是作者在下游编码基因环节创新性不够,并且对Rescue的设计进行了精简,总的来说文章有点浪费,补齐实验完善逻辑的情况下,文章应该能够再上一个档次,IF往上提个1-2分应该没问题,要是再在主变量的创新上下功夫,比如外泌体来源的LncRNA?那应该就是10+的故事了,而且这图实在是……略丑!我们下期见!O(∩_∩)O

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